鋁經(jīng)cAMP-PKA-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑損害大鼠海馬長時(shí)記憶的機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 鋁（aluminium，Al）在生活中接觸十分頻繁。它是非必需的微量元素之一。據(jù)WHO報(bào)道，含鋁的食品添加劑是人民大眾鋁暴露的主要途徑。飲食中鋁的來源有四個(gè)方面，包括飲水，天然食物，含鋁食品添加劑及鋁制炊具、容器。20世紀(jì)70年代前認(rèn)為，鋁與鋁鹽是不被人體所吸收的，無急慢性毒性。70年代中期以來，國內(nèi)外學(xué)者對鋁的毒性展開深入研究后認(rèn)為:鋁的過度接觸和體內(nèi)蓄積可對神經(jīng)系統(tǒng)造成損害。在許多人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如透析性腦

2、病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默癥等，均發(fā)現(xiàn)CNS中存在異常的鋁積聚現(xiàn)象。最近的研究表明，腦鋁與β淀粉樣蛋白有聯(lián)系。β淀粉樣蛋白可以大大削弱海馬的長時(shí)程增強(qiáng)。盡管除了透析性腦病，鋁是否就是這些疾病的病因還存有爭議，但提升劑量確實(shí)能誘發(fā)或加重病理過程。提示，鋁很可能是智力低下性神經(jīng)疾病的一個(gè)重要的環(huán)境致病因子。
　　 當(dāng)前，鋁對于學(xué)習(xí)記憶能力的損害作用及其機(jī)制是神經(jīng)毒理學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)問題。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位。海馬長時(shí)程增

3、強(qiáng)(Long-term potentiation，LTP)是腦學(xué)習(xí)記憶功能在突觸水平的研究模型和細(xì)胞基礎(chǔ)，是公認(rèn)的研究學(xué)習(xí)記憶的電生理模型。LTP的誘導(dǎo)與維持都與學(xué)習(xí)記憶能力緊密相關(guān)，其中晚期長時(shí)程增強(qiáng)(late-phase LTP, L-LTP)與長時(shí)記憶密切相關(guān)，其維持需要新的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。cAMP-PKA-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對于L-LTP的維持至關(guān)重要，在學(xué)習(xí)記憶的信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。鋁可對LTP的維持期造成損害，但

4、相關(guān)機(jī)制并不明確。
　　 本研究采用亞慢性經(jīng)口染鋁（AlCl3水溶液）的方式，建立亞慢性AlCl3暴露導(dǎo)致記憶能力受損的動(dòng)物模型（從子代大鼠出生后立即給予AlCl3染毒，連續(xù)3個(gè)月）。本實(shí)驗(yàn)以仔鼠為研究對象，運(yùn)用病理學(xué)、神經(jīng)行為學(xué)、電生理學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)多種技術(shù)手段，從血和腦內(nèi)的鋁含量、海馬神經(jīng)元和突觸的病理形態(tài)改變、動(dòng)物神經(jīng)行為學(xué)改變、海馬CA1區(qū)L-LTP的誘導(dǎo)和維持、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（受體

5、-G蛋白-AC-cAMP-PKA-CREB通路），以及基因表達(dá)等多角度探討不同劑量水平鋁暴露對于學(xué)習(xí)記憶功能的危害，進(jìn)一步探討相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：
　　 由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的Wistar大鼠60只，體重260±10g，雌雄比例2∶1。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室溫度17～23℃，相應(yīng)濕度45～55％，動(dòng)物飼料由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)將雌鼠分為對照組和低、中、高劑量AlCl3組，然后將雌雄大鼠按2∶1同籠進(jìn)行交配，次日晨發(fā)現(xiàn)

6、陰栓或陰道分泌物鏡檢有精子者定為受孕，記為妊娠第0d。子代大鼠剛出生后記做出生第1d，并立即給予AlCl3染毒。對照組孕鼠在產(chǎn)子后飲用蒸餾水，低、中、高劑量AlCl3組孕鼠在產(chǎn)子后分別飲用0.2％、0.4％、0.6％ AlCl3蒸餾水溶液。各染鋁組仔鼠在斷乳前經(jīng)由吸吮母乳染鋁，斷乳后則通過自行飲水?dāng)z鋁，至出生后3個(gè)月結(jié)束，然后進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。
　　 采用原子吸收光譜法測定仔鼠血液和海馬組織鋁含量，稱量體重及臟器系數(shù)，采用跳臺(tái)實(shí)

7、驗(yàn)、穿梭箱實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測定仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，采用HE染色法觀察仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，采用透射電鏡技術(shù)觀察仔鼠海馬組織神經(jīng)元和神經(jīng)突觸超微結(jié)構(gòu)，采用細(xì)胞外微電極記錄技術(shù)檢測染鋁動(dòng)物大鼠海馬CAl-CA3途徑L-LTP的誘導(dǎo)和維持情況，采用Fura-2熒光探針法測定細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，采用放射免疫法(RIA)測定各組仔鼠海馬組織中cAMP濃度，采用免疫印跡(Westem blot)法測定各組仔鼠海馬組織中PKA和c-J

8、un蛋白含量，采用免疫組織化學(xué)法測定各組仔鼠海馬組織中胞核內(nèi)磷酸化CREB含量、胞漿內(nèi)BDNF蛋白含量，采用RT-PCR法測定各組仔鼠海馬BDNF mRNA表達(dá)水平，采用免疫熒光組化染色技術(shù)測定各組仔鼠海馬組織中BDNF蛋白含量，并用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察和攝片。
　　 結(jié)果：
　　 一、AlCl3對大鼠記憶能力和海馬超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 1、不同劑量鋁暴露對仔鼠體重、海馬及腦系數(shù)等的影響
　　 各劑量

9、組仔鼠的體重與對照組相比呈現(xiàn)不同程度的降低趨勢。各劑量組的海馬系數(shù)、腦系數(shù)和海馬/腦比值與對照組相比均呈現(xiàn)不同程度的升高趨勢。
　　 2、各組仔鼠血液和海馬組織中鋁含量測定
　　 染鋁各組仔鼠的血鋁濃度均顯著高于對照組(P＜0.01)，且隨著鋁暴露劑量的增加，血鋁濃度呈現(xiàn)一定的升高趨勢;腦鋁的變化趨勢與血鋁一致。
　　 3、各組仔鼠在學(xué)習(xí)、記憶（神經(jīng)）行為學(xué)方面的結(jié)果評價(jià)
　　 (1)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)
　　

10、 在仔鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，學(xué)習(xí)反應(yīng)時(shí)間隨染鋁劑量的增加而延長，高劑量組學(xué)習(xí)反應(yīng)時(shí)間顯著長于對照組(P＜0.01)。學(xué)習(xí)錯(cuò)誤次數(shù)隨染鋁劑量的增加而增加，并有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05);在仔鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，隨著染毒劑量的增加，各劑量組記憶潛伏期有顯著縮短的趨勢。記憶錯(cuò)誤次數(shù)隨染鋁劑量的增加而增加，各組之間有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。
　　 (2)穿梭箱實(shí)驗(yàn)
　　 被動(dòng)逃避反應(yīng)指標(biāo)中，在電擊次數(shù)方面，高、中劑量組

11、與對照組比較，電擊次數(shù)顯著增多，差異具有顯著性(P＜0.01)。在電擊時(shí)間方面，中、高劑量組顯著高于對照組(P＜0.01);在主動(dòng)逃避時(shí)間和主動(dòng)逃避潛伏時(shí)間方面，中、高劑量組與對照組比較，兩項(xiàng)指標(biāo)均顯著延長(P＜0.01)，且與低劑量組比較也顯著延長(P＜0.01)。
　　 (3) Moris水迷宮實(shí)驗(yàn)
　　 在仔鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，隨著染鋁劑量的增加，仔鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間逐漸延長并有一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P＜0.

12、01)。與對照組比較，低、中、高劑量組的潛伏期增大，具有顯著性差異(P＜0.05);隨著染鋁劑量的增加，仔鼠的平均速度在實(shí)驗(yàn)過程中逐漸降低，運(yùn)行軌跡呈現(xiàn)越來越復(fù)雜的趨勢。
　　 4、各組仔鼠海馬內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 HE染色后，各劑量組隨著染毒劑量的增加，光鏡下神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)典型的神經(jīng)細(xì)胞受損傷樣改變:染色明顯減弱，數(shù)目減少，細(xì)胞層次少而不清，脫失現(xiàn)象明顯，細(xì)胞空泡變性較明顯。
　　 5、各組仔鼠海馬神經(jīng)

13、元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察
　　 隨著染毒劑量的增加，海馬神經(jīng)元細(xì)胞核膜界限模糊，甚至局部有斷裂，部分細(xì)胞質(zhì)溶解，無法辨認(rèn)細(xì)胞器。核內(nèi)常染色質(zhì)減少，異染色質(zhì)增加，核內(nèi)有空泡樣改變。核仁不規(guī)則、邊集。線粒體腫脹，嵴大部分溶解。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變短并有中度擴(kuò)張;隨著鋁暴露濃度的增加，海馬突觸活性帶變短，突觸后致密物較少，突觸間隙變窄，突觸小泡較少，甚至突觸內(nèi)有空泡現(xiàn)象。
　　 二、AlCl3對大鼠海馬細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和CA1區(qū)L-LTP的影響

14、
　　 （一）不同劑量鋁暴露對各組仔鼠海馬CA1區(qū)L-LTP的影響
　　 1、HFS前反應(yīng)
　　 隨著染毒劑量的增加，各組仔鼠高頻刺激前PS平均幅值略有降低的趨勢，但各劑量組間不具有顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2、HFS后反應(yīng)
　　 (1)不同劑量鋁暴露對各組仔鼠LTP和LTD發(fā)生率的影響
　　 HFS后，隨著鋁暴露劑量的增加，與對照組相比，各鋁暴露組L-LTP發(fā)生率逐漸降低，甚至

15、部分動(dòng)物出現(xiàn)了LTD，尤其在高劑量組情況最為嚴(yán)重。而LTD發(fā)生率隨著鋁暴露劑量的增加有逐漸升高的趨勢，高劑量組LTD發(fā)生率明顯高于對照組和低劑量組。對照組L-LTP發(fā)生率為85.71％;低劑量組L-LTP發(fā)生率為75.00％;中劑量組L-LTP發(fā)生率為75.00％，LTD發(fā)生率為12.50％;高劑量組L-LTP發(fā)生率為66.67％，LTD發(fā)生率為22.22％。
　　 (2)不同劑量鋁暴露對各組仔鼠HFS后PS平均幅值增強(qiáng)率的影響

16、
　　 隨著染毒劑量的增加，各組仔鼠高頻刺激后PS平均幅值增強(qiáng)率明顯下降，各劑量組間具有顯著性差異，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。與對照組相比，低、中、高劑量組PS平均幅值增強(qiáng)率降低，各組間均具有顯著性差異(P＜0.05);與低劑量組相比，中、高劑量組PS平均幅值增強(qiáng)率降低，各組間均具有顯著性差異(P＜0.05);與中劑量組相比，高劑量組PS平均幅值增強(qiáng)率降低，但兩組間比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。
　　

17、 （二）各組仔鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化
　　 隨著鋁暴露劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度逐漸降低。低、中、高劑量AlCl3組仔鼠海馬細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯低于對照組，差異均具有顯著性(P＜0.01)。與低劑量組相比，中、高劑量AlCl3組仔鼠海馬細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低，且有顯著性差異，(P＜0.05)。
　　 三、AlCl3對大鼠海馬cAMP-PKA-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　 1、AlCl3對各

18、組仔鼠海馬c-AMP濃度的影響
　　 L-LTP后，中、高劑量組仔鼠海馬c-AMP濃度與對照組比較均顯著降低，差異具有顯著性(P＜0.05)，低劑量組比對照組濃度低，但差異不具有顯著性(P＞0.05);高劑量組c-AMP濃度顯著低于低、中染鋁組，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 2、AlCl3對各組仔鼠海馬PKA蛋白含量的影響
　　 L-LTP后，對照組、低、中、高劑量組仔鼠海馬PKA蛋白表達(dá)水平隨著染毒劑

19、量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。各劑量組與對照組相比，PKA蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異具有顯著性(P＜0.01);中、高劑量組與低劑量組相比，PKA蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異具有顯著性(P＜0.01);高劑量組與低劑量組之間比較，PKA蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 3、AlCl3對各組仔鼠海馬內(nèi)p-CREB蛋白含量的影響
　　 L-LTP后，子代大

20、鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和皮質(zhì)區(qū)p-CREB的累積積分光密度隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在CA1區(qū)，中、高劑量組與對照組相比累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.05)，高劑量組與低劑量組相比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.05);在CA3區(qū)，中、高劑量組與對照組相比累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.05)，高劑量組與低劑量組相比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01);在皮質(zhì)區(qū)，低、

21、中、高劑量組與對照組相比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 4、AlCl3對各組仔鼠海馬內(nèi)BDNF mRNA表達(dá)的影響
　　 L-LTP后，隨著染毒劑量的增加，對照組、低、中、高劑量組海馬內(nèi)的BDNFmRNA表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。各劑量組海馬內(nèi)BDNFmRNA表達(dá)與對照組比較均降低，差異具有顯著性

22、(P＜0.01);中、高劑量組與低劑量組比較，海馬內(nèi)的BDNF mRNA表達(dá)均下降，差異具有顯著性(P＜0.05);高劑量組與中劑量組比較，海馬內(nèi)的BDNF mRNA表達(dá)下降，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 5、AlCl3對各組仔鼠海馬內(nèi)BDNF蛋白含量的影響
　　 (1)免疫組化法
　　 L-LTP后，子代大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和皮質(zhì)區(qū)BDNF累積積分光密度隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在C

23、A1和CA3區(qū)，中、高劑量組與對照組相比累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組相比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，高劑量組與中劑量組相比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.05);在皮質(zhì)區(qū)，中、高劑量組與對照組相比累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組相比累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　 L-LTP后

24、，子代大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和皮質(zhì)區(qū)BDNF陽性面積比隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在CA1和CA3區(qū)，中、高劑量組與對照組相比陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組相比，陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，高劑量組與中劑量組相比，陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01);在皮質(zhì)區(qū)，低、中、高劑量組與對照組相比陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑

25、量組相比陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，高劑量組與中劑量組相比，陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 (2)免疫熒光組化染色法
　　 L-LTP后，子代大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、皮質(zhì)區(qū)和DG區(qū)BDNF的平均熒光強(qiáng)度隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在CA1區(qū)，中、高劑量組與對照組相比平均熒光強(qiáng)度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，高劑量組與低劑量組相比，平均熒光強(qiáng)度降低，差異具有

26、顯著性(P＜0.01)，高劑量組與中劑量組性比，平均熒光強(qiáng)度降低，差異具有顯著性(P＜0.05);在CA3區(qū)，中、高劑量組與對照組相比平均熒光強(qiáng)度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組相比平均熒光強(qiáng)度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。在皮質(zhì)區(qū)，中、高劑量組與對照組相比平均熒光強(qiáng)度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組相比平均熒光強(qiáng)度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。高劑量組與中劑量組比

27、，平均熒光強(qiáng)度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。在DG區(qū)，低、中、高劑量組與對照組相比平均熒光強(qiáng)度降低，差異具有顯著性(P＜0.05)，高劑量組與低劑量組相比，平均熒光強(qiáng)度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，高劑量組與中劑量組相比，平均熒光強(qiáng)度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 6、AlCl3對各組仔鼠海馬內(nèi)c-Jun蛋白含量的影響
　　 L-LTP后，隨著染毒劑量的增加，對照、低、中、高劑量組海馬內(nèi)c-

28、Jun蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P＜0.01)。各劑量組海馬內(nèi)c-Jun蛋白含量與對照組比較均降低，差異具有顯著性(P＜0.01);中、高劑量組與低劑量組比較，海馬內(nèi)的c-Jun蛋白含量均下降，差異具有顯著性(P＜0.01);高劑量組與中劑量組比較，海馬內(nèi)c-Jun蛋白含量略下降，但差異不具有顯著性(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、出生后亞慢性AlCl3暴露導(dǎo)致仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力低下，海馬神

29、經(jīng)細(xì)胞形態(tài)異常，海馬神經(jīng)元和神經(jīng)突觸的超微結(jié)構(gòu)受到損害。
　　 2、出生后亞慢性AlCl3暴露引起仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度降低，損害仔鼠海馬CA1區(qū)L-LTP誘導(dǎo)和維持，降低L-LTP發(fā)生率和PS平均幅值增強(qiáng)率，并導(dǎo)致產(chǎn)生LTD，從而產(chǎn)生損害作用，影響仔鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。
　　 3、出生后亞慢性AlCl3暴露降低仔鼠海馬c-AMP濃度，減少PKA蛋白含量，降低p-CREB活化水平，造成與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)的cAMP