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文檔簡介
1、目的：構(gòu)建人蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Protein Kinase R-like ERkinase，PERK)慢病毒載體并包裝慢病毒顆粒(Lentivirus)，探討軟骨細(xì)胞中PERK基因慢病毒修飾對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的作用;同時建立雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)PGRN-/-小鼠的關(guān)節(jié)炎模型。
方法：應(yīng)用慢病毒載體系統(tǒng)pWPT-GFP-PERK與慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2G、pSPAX2共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中，進(jìn)一步包裝形成PERK慢病毒(LV-P
2、ERK)（詳見第一部分）;培養(yǎng)成肌細(xì)胞C2C12，用衣霉素（tunicamycin，TM）誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER Sress)，觀察PERK在ER Sress狀態(tài)下對C2C12細(xì)胞增殖與凋亡的影響（詳見第二部分）;并將C3H10及ATDC5細(xì)胞微團培養(yǎng)，在BMP2誘導(dǎo)不同時間點分別感染LV-PERK、LV-GFP，檢測其對軟骨分化過程中凋亡的影響（詳見第三部分）;將雞Ⅱ型膠原(COLII)與弗氏完全佐劑(FCA)等體積混合后通過尾部皮下注
3、射PGRN-/-小鼠，3周后進(jìn)行等量注射同樣的COLII，觀察PGRN-/-小鼠是否出現(xiàn)炎癥性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)癥狀（詳見第三部分）。
結(jié)果：成功構(gòu)建和包裝了人PERK重組慢病毒;在TM誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的狀態(tài)下，PERK能加速細(xì)胞的凋亡;在BMP2誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞C3H10及ATDC5分化的過程下，PERK能減少分化過程中軟骨細(xì)胞的凋亡。成功建立雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的PGRN-/-小鼠關(guān)節(jié)炎模型。
結(jié)論：在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的狀態(tài)下，PERK
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