基于TLR2-4信號(hào)通路研究芍藥苷抑制糖尿病腎臟巨噬細(xì)胞激活的分子機(jī)制.pdf

1、背景和目的：糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy, DN）仍然是終末期腎功能衰竭（end-stage renal failure, ESRF）的主要病因之一，關(guān)于DN的發(fā)病機(jī)制及其治療的研究一直是學(xué)者們密切關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來(lái)眾多證據(jù)表明，巨噬細(xì)胞腎臟內(nèi)浸潤(rùn)和激活，引發(fā)相關(guān)炎癥因子釋放，如促炎因子水平的增加和NF-κB活化，加速了DN發(fā)展，但對(duì)糖尿病腎組織巨噬細(xì)胞激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚待闡明。
　　Toll樣受體(To

2、ll like receptors, TLRs)是先天免疫系統(tǒng)中一個(gè)經(jīng)典的膜受體家族，研究證實(shí)其家族成員TLR2和TLR4受體可以和糖尿病狀態(tài)下的病理產(chǎn)物結(jié)合，啟動(dòng)自身下游信號(hào)通路，并募集激活巨噬細(xì)胞，開(kāi)啟一系列的炎癥反應(yīng)，持續(xù)加重糖尿病患者的腎臟損傷。近年來(lái)中藥治療在 DN中受到持續(xù)關(guān)注,芍藥苷（Paeoniflorin，PF），白芍總苷的活性成分，其藥理作用可能與抗炎、抗氧化與免疫活性調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究中采用 PF作用于鏈脲佐菌素(s

3、treptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病模型和高糖刺激的小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages，BMDMs)，從整體，細(xì)胞，分子水平觀察TLR2/4信號(hào)通路和促炎癥因子的變化，探討TLR2/4信號(hào)通路參與DN發(fā)生的作用機(jī)制及PF的干預(yù)作用，為DN防治提供新思路。
　　方法：
　　第一部分：取TLR2/4基因敲除小鼠（TLR2/4-/-）及C57BL/6J同窩野生型小鼠骨髓

4、細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為巨噬細(xì)胞。CCK-8方法檢測(cè)PF干預(yù)及高糖刺激對(duì)BMDMs活力的影響。在不同濃度葡萄糖，不同濃度PF，不同時(shí)間點(diǎn)觀察TLR2，TLR4，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）蛋白表達(dá)的變化，從而優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。BMDMs分組：正常對(duì)照組(LG)，正常對(duì)照+PF組（LG+PF），高糖組(HG)，高糖+PF組(HG+PF)，TLR2-/-對(duì)照組（TLR2-/-），TLR2-

5、/-對(duì)照+高糖組（TLR2-/-+HG），TLR2-/-對(duì)照+高糖+PF組（TLR2-/-+HG+PF），TLR4-/-對(duì)照組（TLR4-/-），TLR4-/-對(duì)照+高糖組（TLR4-/-+HG），TLR4-/-對(duì)照+高糖+PF組（TLR4-/-+HG+PF）。于刺激的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，另收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心后供ELISA檢測(cè)。觀察高糖刺激下PF干預(yù)，TLR2/4基因敲除對(duì)BMDMs趨化功能的影響；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)BMDMs在高糖誘

6、導(dǎo)下的極化分型；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法（Quantitative Real-time PCR）測(cè)定各分組細(xì)胞中 IL-1β，TNF-α，MCP-1及iNOS mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；Western blot檢測(cè)各組總蛋白中TLR2，TLR4，MyD88，Trif，p-IRAK-1，p-IRF3，IRF3，NF-κB p65，NF-κB p-p65，iNOS蛋白的表達(dá)；ELISA試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中促炎癥因子TNF-α，IL-1β，MC

7、P-1的分泌情況。
　　第二部分：健康雄性TLR2/4基因敲除（TLR2/4-/-）及C57BL/6J同窩野生型小鼠腹腔注STZ，50mg/kg，共5天，注射一周后測(cè)尾靜脈隨機(jī)血糖，血糖＞16.7mmol/L者確定為糖尿病模型。將模型小鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組，PF給藥（25，50，100mg/kg.d）組，TLR2-/-糖尿病模型組，TLR4-/-糖尿病模型組，每組各12只；另取健康雄性C57BL/6J同窩野生型小鼠，TLR2/4

8、基因敲除鼠作為正常對(duì)照組，每組各12只。于用藥后第12周末收集各組小鼠血、尿和腎組織標(biāo)本，測(cè)定血糖、體重、腎重以及24h尿白蛋白排泄率；觀察腎組織病理改變；免疫組化檢測(cè)CD68，TLR2，TLR4及NF-κB p65蛋白表達(dá)；western blot檢測(cè)腎組織TLR2，TLR4，MyD88，Trif，p-IRAK-1，p-IRF3，IRF3，NF-κB p65，NF-κB p-p65蛋白的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TNF-α，MCP-1，

9、IL-1β及iNOS的mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分：①與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)所需濃度的PF對(duì)高糖誘導(dǎo)的BMDMs生長(zhǎng)活力無(wú)明顯影響(P>0.05)。②高糖誘導(dǎo)刺激可以增加MCP-1對(duì)巨噬細(xì)胞的趨化，PF干預(yù)和 TLR2/4基因敲除均可以抑制高糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移(P<0.01)。③流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：高糖的刺激可成功使BMDMs向M1功能表型極化；PF干預(yù)和TLR2/4基因缺失組細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記CD11c百分比明顯降低

10、（P<0.01）。④實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與LG組相比，HG組細(xì)胞TNF-α，MCP-1，IL-1β及iNOS mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；PF干預(yù)組和TLR2/4基因敲除組上述mRNA表達(dá)與HG組相比明顯下調(diào)(P<0.05；P<0.01)。⑤Western blot結(jié)果顯示，HG組iNOS蛋白及TLR2，TLR4，MyD88，Trif，p-IRAK-1，p-IRF3，IRF3, NF-κB p-p65，NF-κB

11、 p65信號(hào)通路蛋白表達(dá)與LG組相比明顯增強(qiáng)（P<0.01）；PF干預(yù)使得上述蛋白表達(dá)明顯抑制（P<0.05； P<0.01）；TLR2基因敲除可使 TLR2，MyD88，p-IRAK-1，NF-κB p65，NF-κB p-p65，iNOS蛋白表達(dá)明顯低于HG組（P<0.01）；但在TLR2基因敲除組Trif，p-IRF3, IRF3的表達(dá)較HG組無(wú)明顯變化(P>0.05)；TLR4基因敲除可使TLR4，MyD88，Trif，p-IR

12、AK-1，p-IRF3，IRF3，NF-κB p-p65，NF-κB p65，iNOS蛋白表達(dá)明顯低于HG組（P<0.01）。⑥Elisa方法檢測(cè)結(jié)果示，HG組細(xì)胞培養(yǎng)基中所含TNF-α，IL-1β，MCP-1較LG組增加明顯；PF干預(yù)組和TLR2/4-/-+HG組巨噬細(xì)胞TNF-α，IL-1β，MCP-1的蛋白分泌與HG組相比明顯下調(diào)(P<0.01)。
　　第二部分：①與對(duì)照組相比，12周糖尿病模型組小鼠血糖、腎重/體重及24h

13、尿白蛋白排泄率均明顯升高(P<0.05；P<0.01)；PF干預(yù)治療及 TLR2/4基因敲除可使相應(yīng)小鼠腎重/體重比值，24h尿白蛋白排泄率較模型組小鼠顯著減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；P<0.01)。②光鏡下觀察到12周糖尿病模型組腎組織中腎小球體積增大、系膜細(xì)胞增多、基底膜增厚以及細(xì)胞外基質(zhì)增多，而 PF干預(yù)及TLR2/4基因缺失組小鼠腎臟組織中的上述病理改變得到明顯改善(P<0.05；P<0.01)。③免疫組化結(jié)果顯示，

14、模型組TLR2，TLR4，CD68及NF-κB p65表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；PF干預(yù)及TLR2/4基因敲除可使TLR2，TLR4，CD68及NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。④Western blot結(jié)果顯示，12周糖尿病模型小鼠較對(duì)照組TLR2，TLR4，MyD88，Trif，p-IRAK-1，p-IRF3，IRF3，NF-κB p-p65，NF-κB p65蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；PF干預(yù)

15、及TLR4基因敲除組與模型組相比上述蛋白的表達(dá)明顯下降(P<0.01)；但TLR2的基因缺失對(duì)Trif，p-IRF3, IRF3蛋白表達(dá)無(wú)影響，與糖尿病模型組小鼠相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；⑤實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組促炎癥因子TNF-α，MCP-1，IL-1β及iNOS mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)；PF干預(yù)及TLR2/4基因敲除組與模型組相比，上述指標(biāo)mRNA表達(dá)則明顯抑制(P<0.01)。<

16、br>　　結(jié)論：
　　1.高糖環(huán)境下，BMDMs活化，iNOS高表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)TLR2/4及下游信號(hào)傳導(dǎo)通路表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致促炎癥因子表達(dá)增加，PF干預(yù)及TLR2/4基因敲除抑制上述信號(hào)通路激活，下調(diào)巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，同時(shí)抑制巨噬細(xì)胞的表型變化。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，糖尿病狀態(tài)下 TLR2/4在腎組織內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，伴有腎小球系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)積聚、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)活化等腎臟慢性炎癥病理改變，提示TLR2/4參與糖尿病