多靶點α--螺旋功能模擬分子及其藥靶確認.pdf

1、細胞凋亡受到多條信號轉(zhuǎn)導通路涉及的多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPIs)的精密調(diào)控。細胞內(nèi)PPIs異常是導致細胞凋亡途徑受阻的重要因素。Bcl-2家族蛋白之間的PPIs和p53/MDM2的PPI分別調(diào)控不同的凋亡信號轉(zhuǎn)導通路，是細胞凋亡通路中最受關注的PPIs。它們的相互作用界面都是一段α-螺旋，分別是Bcl-2家族蛋白的BH3螺旋和p53的TAD螺旋。在這些α-螺旋上，只有少量的氨基酸殘基(hotspots)對PPI起到主要作用。因此

2、，設計合成模擬α-螺旋上hotspots的空間位置和理化性質(zhì)的小分子α-螺旋功能模擬物(Small moleculeα-helix mimetics)，能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞凋亡通路中PPIs的調(diào)控，獲得潛在的抗癌藥物和重要的研究用探針工具。
　　目前的小分子α-螺旋功能模擬物存在三個主要缺陷。第一，現(xiàn)有的小分子都只能實現(xiàn)對單個靶蛋白或同家族的PPIs靶蛋白的活性抑制，尚未實現(xiàn)一藥多靶。然而，系統(tǒng)生物學和網(wǎng)絡藥理學研究表明對單一靶標的拮抗

3、不足以廣譜、有效殺死腫瘤細胞。第二，現(xiàn)有的小分子都只能通過解離PPIs抑制靶蛋白活性，無法同時干預靶蛋白水平。以BH3α-螺旋功能模擬物為例，它們無法像BH3-only蛋白一樣在細胞內(nèi)降低特定靶蛋白的水平，導致必須高濃度的小分子持續(xù)作用才能夠有效抑制靶蛋白活性，增加了未來應用中發(fā)生毒副作用的風險。第三，現(xiàn)有的小分子無法在蛋白質(zhì)組水平確認其靶標。由于PPI抑制劑與靶蛋白的親和力遠低于激酶抑制劑，很難以它們?yōu)榛A設計基于活性的分子探針(Ac

4、tivity-based Probes，ABPs)，在活細胞內(nèi)原位捕獲靶蛋白，和在蛋白質(zhì)組水平鑒定其藥靶。這三點缺陷限制了小分子α-螺旋功能模擬物作為抗癌藥物和分子探針的應用，因此發(fā)展多靶點PPIs抑制劑、研發(fā)促進靶蛋白降解的雙功能PPI抑制劑和構建捕獲PPIs的ABPs是本領域亟待解決的關鍵科學問題。
　　首先，本研究通過分析Bim/Mcl-1、Bim/Bcl-2和p53/MDM2蛋白復合物晶體結構的異同，設計了能夠同時模擬具有

5、不同螺旋度的p53TAD和BimBH3α-螺旋的hotspots的α-螺旋功能模擬分子骨架B。B具有骨架半剛性、取代基空間位置可變的分子特征。以B為基礎，獲得了首個能夠同時以sub-μM親和力結合Mcl-1、Bcl-2和MDM2蛋白的多靶點PPIs抑制劑B5。利用體外蛋白質(zhì)活性檢測(FP、ITC)、分子對接、蛋白質(zhì)二維核磁(1H-15N HSQC)和細胞實驗，證明了B5能在腫瘤細胞內(nèi)同時抑制Bax/Bcl-2、Bak/Mcl-1和p53

6、/MDM2之間的相互作用，發(fā)揮基于p53和Bcl-2介導的兩個信號轉(zhuǎn)導通路的抗腫瘤活性。
　　其次，本研究設計合成了首個雙功能α-螺旋功能模擬分子E5。E5不僅能夠解離Mcl-1蛋白參與形成的PPIs，還能夠促進Mcl-1蛋白構象依賴的泛素化降解。利用E5及其衍生物的構效關系分析，結合限制性酶切實驗和質(zhì)譜測序分析、表面等離子體共振實驗(SPR)、蛋白復合物結晶、X-射線晶體衍射實驗、蛋白質(zhì)三維核磁實驗、泛素化檢測和細胞生物學實驗，

7、證明了Q221R222N223motif是Mcl-1蛋白與BH3-only蛋白發(fā)生分子識別的結構基礎。H224殘基是調(diào)控Q221R222N223motif的螺旋-非螺旋構象的“分子開關”，E5通過-COOH取代基與Mcl-1蛋白的H224殘基形成鹽橋和氫鍵，誘導QRN motif形成螺旋構象，利于泛素連接酶Mule的結合，并促進泛素化降解，更高效地誘導Mcl-1依賴的腫瘤細胞的凋亡。
　　最后，本研究通過分析PPI靶標蛋白與小分子

8、抑制劑的結合模式，設計了一種新型的適用于在蛋白質(zhì)組水平原位捕獲PPIs靶標蛋白的“分叉型”光交聯(lián)linker L1，并利用L1構建了基于活性的分子探針C2，首次實現(xiàn)了Bcl-2家族蛋白在蛋白質(zhì)組水平的原位靶標確認。利用C2在體外和活細胞內(nèi)分別捕獲和熒光標記了已知的Bcl-2蛋白，證明L1捕獲PPIs靶點的效率高于目前廣泛應用的“minimalist”linker。同時，還發(fā)現(xiàn)微管蛋白可能是Bcl-2抑制劑的潛在藥靶，初步證明了微管蛋白是