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1、脂肪族芥子油苷(aliphatic glucosinolates,AGSL)是一種廣泛存在于十字花科植物中的含氮、含硫的植物次生代謝產(chǎn)物,其降解產(chǎn)物(如蘿卜硫素)不僅在植物防御、響應(yīng)生物或非生物脅迫的生理過(guò)程中具有重要的作用,而且還具有極強(qiáng)的抗癌活性。MYB28和MYB29是調(diào)控脂肪族GSL生物合成的兩類重要轉(zhuǎn)錄因子,其功能已在模式植物擬南芥中研究的較為清楚。在十字花科蔬菜中,青花菜中的芥子油苷含量最為豐富,成分更為復(fù)雜,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)青
2、花菜 AGSL生物合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因研究的較多,而對(duì)其中起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子的研究則相對(duì)較為滯后。本研究以高蘿卜硫素青花菜“福青1號(hào)”為材料,克隆了MYB28和MYB29兩種轉(zhuǎn)錄因子,并對(duì)其表達(dá)模式以及功能進(jìn)行初步了分析,主要研究結(jié)果如下:
(1)通過(guò)同源克隆的方法,克隆出青花菜脂肪族芥子油苷合成調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MYB28的2個(gè)同源基因(BoMYB28-1、BoMYB28-2)和MYB29的2個(gè)同源基因(BoMYB29-1和Bo
3、MYB29-2)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),這四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子核苷酸序列與其他物種同類基因的同源性較高,均含有明顯的MYB家族R2R3型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu),初步確定它們?yōu)榍嗷ú薆oMYB28和BoMYB29基因。上述四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子提交至 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)分別為:KM262765.1、KM262766.1、KM262767.1和KM262768.1。
(2)分別構(gòu)建了BoMYB28-1、BoMYB28-2、BoMYB29-1和BoMY
4、B29-2基因的亞細(xì)胞定位載體,并進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),結(jié)果顯示在洋蔥表皮細(xì)胞核中均出現(xiàn)明顯的綠色熒光,表明BoMYB28-1、BoMYB28-2、BoMYB29-1和BoMYB29-2基因定位于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子基因。
?。?)熒光定量PCR分析結(jié)果表明,四個(gè)同源基因在青花菜不同組織中基因的表達(dá)量存在顯著差異。其中BoMYB28-1在花球中表達(dá)量最高,約是根中的100倍,隨著莖、葉和花逐漸降低。在種子中BoMYB28-1的表達(dá)量幾乎檢
5、測(cè)不到。BoMYB28-2基因在莖中表達(dá)最高,較根中的表達(dá)量略高?;ㄇ蚝突ㄖ械谋磉_(dá)量略少于根,在葉中的表達(dá)量很少,種子中幾乎見(jiàn)不到表達(dá)。BoMYB29-1基因的表達(dá)量在花球中的最高,約是根中表達(dá)量的6倍,莖和葉中的表達(dá)量相似,略低于花球,在種子中的表達(dá)量較根略高。BoMYB29-2基因的表達(dá)在花球中的表達(dá)量最高,大約是根中的3倍,在莖中的表達(dá)量較花球中略低,隨著葉、根和花逐漸降低,在種子中幾乎檢測(cè)不到基因的表達(dá)量。用MeJA和蔗糖對(duì)青花
6、菜進(jìn)行脅迫處理分析發(fā)現(xiàn),四個(gè)同源基因的表達(dá)量隨著處理的時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,并分別在15 min和2 h時(shí)達(dá)到最高,隨后表達(dá)量逐漸降低至初始狀態(tài)。
?。?)構(gòu)建了四個(gè)同源基因的過(guò)量表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中,分別獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著轉(zhuǎn)錄因子BoMYB28-1、BoMYB28-2、BoMYB29-1和BoMYB29-2基因表達(dá)量的增加,脂肪族芥子油苷的含量有了顯著改變。其中,在BoMYB28-1和BoMYB28-
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