貴陽市耐多藥結核分枝桿菌耐藥突變特征及散在分布重復單位基因分型.pdf

1、目的：了解貴陽地區(qū)耐多藥結核分枝桿菌rpoB基因、katG基因、inhA啟動子和oxyR-aphc間隔區(qū)基因突變特征，為耐藥基因芯片法檢測的完善和推廣應用提供實驗依據；應用分枝桿菌散在重復單位分型法（MIRU）對86株結核分枝桿菌進行分子分型，了解本地結核分枝桿菌耐多藥分子分型特征；比較 MIRU12個位點對本地菌株進行分子分型的分辨率。
　　方法:
　　1、采用羅氏培養(yǎng)法從患者痰標本中分離培養(yǎng)結核分枝桿菌，以間接比例法檢測

2、結核分枝桿菌臨床菌株對異煙肼、利福平的敏感性；
　　2、提取結核分枝桿菌DNA，對31株結核分枝桿菌臨床分離株(耐多藥17株，敏感株14株)的rpoB基因、katG基因、inhA啟動子和oxyR-aphc間隔區(qū)進行DNA片段的PCR擴增，并進行測序分析；
　　3、在GenBank中下載H37Rv的rpoB基因、katG基因、inhA啟動子和oxyR-aphc間隔區(qū)序列與氨基酸序列，采用CLC Free Workbench4.

3、5進行比對分析，了解本地區(qū)耐藥相關rpoB基因、katG基因、inhA啟動子和oxyR-aphc間隔區(qū)基因突變的多樣性；
　　4、分別對86株結核分枝桿菌（耐多藥菌株46株，敏感菌株40株）MIRU12個位點進行PCR擴增。擴增產物以2.0％瓊脂糖凝膠進行電泳，使用100bp DNA Ladder做標志。應用凝膠成像儀分析擴增產物的大小，計算相應 MIRU位點的拷貝數。選取部分菌株 MIRU12個位點的PCR擴增產物進行測序，以在

4、線重復序列分析軟件對各序列分析散在分布重復單位拷貝數;
　　5、利用NTsys2.10e軟件對全部基因型數字化的結果行非加權組平均法（UPGMA）聚類分析。計算各 MIRU位點分辨力大小;
　　6、應用卡方檢驗檢測年齡、性別及基因型與本地結核分枝桿菌耐多藥相關性。
　　結果：
　　1、17株結核分枝桿菌耐多藥菌株中有12株檢出rpoB基因變異，其中7株為531位TCG→TTG變異，2株為CAC526TAC變異,A

5、TC533TTC、ATC565TTC變異各1株，1株為CTG530ATG與TCG526TTC聯(lián)合突變，5株耐多藥菌株rpoB基因沒有檢出突變。敏感菌株均未檢出變異。rpoB530和565變異位點存在于基因芯片法檢測范圍外。
　　2、17株耐多藥結核分枝桿菌中有16株檢出katG基因突變，其中70.5%(12/17)為315位密碼子變異，且變異類型均為 AGC→ACC，敏感株未發(fā)現(xiàn)315位點突變。11株敏感菌和4株耐藥菌在katG4

6、63位密碼子發(fā)生變異，變異類型均為CGG→TGG，變異率分別為78.6%（11/14）和23.5%(4/17)，敏感菌和耐藥菌變異率相比，χ2值為6.28，P＞0.05，差異無顯著性。有12株耐藥株的變異類型為 katG基因雙重位點突變，其中10株為 katG315(AGC→ACC)和463(CGG→TGG)位變異，463(CGG→TGG)和299(GGC→AGC)變異及463(CGG→TGG)和419(GAC→CAC)位變異各1株。2

7、株異煙肼耐藥菌檢出oxyR-aphC啟動區(qū) G32A突變，其中1株為聯(lián)合 katG463和299位突變。katG299,419及oxyR-aphC-G32A位點變異在基因芯片檢測法范圍外。
　　3、MIRU12位點法將86株結核分枝桿菌分為I，II，III，IV四個基因群，75個基因型，其中70個獨立基因型。I群包含結核分枝桿菌64株，占全部菌株的74.40%，為本地的優(yōu)勢菌株。I群中耐多藥結核分枝桿菌36株，敏感菌株28株。

8、r>　　4、除70株獨立基因型外的16株菌分型成5簇，最大簇包含5株菌，最小簇包含2株菌。成簇率為18.60%。
　　5、12個MIRU位點中，位點26、31顯示高等程度多態(tài)性，其中位點26顯示多態(tài)性最高，h為0.704；位點3l，10，39，16，40，23，2顯示中等程度的多態(tài)性；位點4，20，27，24顯示較低多態(tài)性；位點24只有一種等位基因型。6、經卡方檢驗，不同性別、年齡及基因型別菌株耐多藥率經χ2檢驗，χ2值分別為6.

9、48，6.48，10.23，P均大于0.05。
　　結論：
　　1、貴陽耐多藥結核分枝桿菌利福平耐藥基因突變主要的變異類型為rpoB531及rpoB526位點突變；
　　2、貴陽耐多藥結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變主要的變異類型為katG315位點突變；
　　3、貴陽耐多藥結核分枝桿菌存在芯片（博奧生物有限公司）法檢測不涵蓋的耐藥基因突變；
　　4、貴陽市結核分枝桿菌具有遺傳多樣性，I群為本地結核分枝桿菌主