脆弱擬桿菌CcrA酶與頭孢菌素類抗生素之間的分子識別和相互作用.pdf

1、超級細菌的出現(xiàn)使得臨床上使用的多數(shù)β-內酰胺類抗生素失效，這主要是因為其可以產生一種水解抗生素的金屬β-內酰胺酶，脆弱擬桿菌產生的金屬β-內酰胺酶CcrA是一種典型的金屬酶，但目前對其與該類抗生素之間的結合過程研究比較少，對此，本研究采用實驗測定和理論預測相結合的方法，進行對金屬β-內酰胺酶CcrA與頭孢噻肟(CTX)和頭孢他啶(CAZ)之間分子識別和相互作用機理的研究，主要內容如下:
　　1.在大腸桿菌中對金屬β-內酰酶CcrA

2、進行誘導表達，通過鎳離子親和層析法實現(xiàn)對目的蛋白的分離純化，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對蛋白進行鑒定，最后通過Bradford法測定蛋白的含量。結果表明，該過程實現(xiàn)了對目的蛋白CcrA的高效表達，且純化后CcrA酶的純度較高，蛋白含量為0.26-0.28mg/mL。
　　2.利用熒光光譜法對CcrA酶與兩種頭孢菌素類抗生素（CTX和CAZ）之間的分子識別和相互作用進行研究。測定了三個溫度下(277K、281K、2

3、85K)抗生素和CcrA酶相互作用的熒光光譜，獲得了二者結合過程中的熒光猝滅常數(shù)Ksv和猝滅速率常數(shù)Kq、結合常數(shù)Ka、結合位點數(shù)n以及結合過程中的熱力學參數(shù)等。實驗結果表明，兩種抗生素與CcrA酶之間發(fā)生的猝滅均為靜態(tài)猝滅;在相同溫度下，CcrA酶與CTX結合體系的Ksv和Kq均大于CcrA酶與CAZ結合體系，且CcrA酶與CTX結合體系的結合常數(shù)Ka和結合位點數(shù)n也比較大，這表明CcrA酶與CTX的結合能力大于CcrA酶與CAZ，同

4、時也表明，結合過程生成的CcrA-CTX復合物穩(wěn)定性比較高。實驗結果得出，CcrA酶與兩種抗生素在結合過程中的吉布斯自由能、焓變等均為負值，表明CcrA酶與CTX、CAZ之間的相互作用是一個自發(fā)、放熱的過程。
　　3.通過分子對接模擬方法研究了在CcrA酶與CTX、CAZ之間相互識別和作用過程中，酶分子內氨基酸殘基和小分子配體中官能團的相互作用模式。分析發(fā)現(xiàn)位于酶分子活性口袋附近的loop環(huán)柔性變化較大，表明二者在相互作用過程中，