日本七鰓鰻唾液腺分泌蛋白的組分分析與鑒定.pdf

1、在海洋生物中,七鰓鰻(lampetra japonica)是迄今所知道的最原始的無(wú)頜類(lèi)脊椎動(dòng)物,不僅是研究脊椎動(dòng)物起源與進(jìn)化的關(guān)鍵物種,同時(shí)也是研究脊椎動(dòng)物發(fā)育與分化的最佳模式動(dòng)物之一。此外,日本七鰓鰻唾液腺分泌的多種活性物質(zhì)賦予其極為特殊的寄生生活習(xí)性。以成功構(gòu)建的日本七鰓鰻唾液腺cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)開(kāi)展的前期研究中,已證實(shí)日本七鰓鰻唾液腺的分泌物質(zhì)中存在抗凝、抗炎、抗腫瘤以及抗氧化等多種活性分子。然而,對(duì)于分泌物中含有的其他蛋白成分及

2、其機(jī)制尚不明確。本研究對(duì)日本七鰓鰻的唾液腺分泌蛋白的組分進(jìn)行分析與鑒定,旨在發(fā)現(xiàn)和研究與其特殊的寄生生活方式相適宜的特有功能蛋白質(zhì)。利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等手段從蛋白和基因兩種水平對(duì)日本七鰓鰻唾液腺分泌蛋白的組分進(jìn)行鑒定分析,獲得了分泌物中低含量蛋白的組成信息,并選擇新活性氧調(diào)節(jié)基因、血清白蛋白和細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子樣蛋白進(jìn)行克隆、進(jìn)化、表達(dá)和活性分析。這有利于揭示日本七鰓鰻唾液腺分泌的功能基因在同系家族中的起源與進(jìn)化,并為日本七鰓鰻特

3、殊的寄生生活習(xí)性提供更多的理論基礎(chǔ)。
　　 本研究利用SDS-PAGE電泳技術(shù)進(jìn)行日本七鰓鰻唾液腺分泌低含量蛋白的分離,以基質(zhì)輔助激光解析電離化／飛行時(shí)間(MALDI-TOF-MS)質(zhì)譜測(cè)序手段進(jìn)行低含量蛋白的質(zhì)譜測(cè)序,將結(jié)果在Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜檢索(MS／MS Ion Search),從而鑒定日本七鰓鰻唾液腺分泌低含量蛋白的蛋白組成。選擇的六條膠帶經(jīng)質(zhì)譜測(cè)序分別獲得了312、129、137、283、299和248個(gè)

4、蛋白質(zhì)肽段,其中重要的匹配記錄分別為20、9、7、9、20和10項(xiàng)；與唾液腺cDNA文庫(kù)比較后發(fā)現(xiàn)匹配上的和未匹配上的肽段總數(shù)目皆為19個(gè)；最后將未匹配的蛋白重新查詢(xún),最終獲得了細(xì)胞骨架蛋白、代謝酶類(lèi)、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)蛋白和脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白等共計(jì)21種有意義蛋白。
　　 利用生物信息學(xué)手段解析日本七鰓鰻血清白蛋白及類(lèi)白蛋白基因家族的分子進(jìn)化與系統(tǒng)發(fā)育,獲得類(lèi)白蛋白基因家族成員演化圖以及日本七鰓鰻血清白蛋

5、白、鮭魚(yú)血清白蛋白以及斑馬魚(yú)維生素D結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域水平上三者之間的進(jìn)化關(guān)系,證實(shí)了日本七鰓鰻血清白蛋白在進(jìn)化上獨(dú)特而原始的地位。
　　 利用基因工程手段,克隆得到的日本七鰓鰻新活性氧調(diào)節(jié)功能基因Lj-Romol開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)243 bp,編碼80個(gè)氨基酸,分子量大約8.9KDa；具有信號(hào)肽,且可作為跨膜蛋白定位于線(xiàn)粒體膜上；一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及三維立體結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果均表明了Lj-Romol基因與其他物種的高度同源性；進(jìn)化水平的

6、分析則驗(yàn)證了Lj-Romol的原始進(jìn)化地位；以semi-PCR技術(shù)檢測(cè)Lj-Romol在日本七鰓鰻各組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)Lj-Romol在日本七鰓鰻各組織中廣泛表達(dá),其中紅細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量最高,且模擬病原菌刺激后各組織中Lj-Romol表達(dá)量明顯上調(diào),證明Lj-Romol參與紅細(xì)胞的氧化還原信號(hào)通路；原核表達(dá)沒(méi)有獲得Lj-Romol的重組蛋白,揭示其序列中可能含有稀有密碼子；進(jìn)一步進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)Lj-Romol基因的亞細(xì)胞定位于線(xiàn)

7、粒體上,初步證實(shí)了Lj-Romol參與機(jī)體線(xiàn)粒體內(nèi)的有氧呼吸過(guò)程。
　　 利用生物信息學(xué)手段研究日本七鰓鰻細(xì)胞死亡因子Grimin基因序列的基本性質(zhì),證實(shí)其為具有疏水性的單層跨膜蛋白,不含信號(hào)肽和糖基磷脂酰肌醇錨定位點(diǎn),具有氧化還原酶活性,在細(xì)胞內(nèi)可作為轉(zhuǎn)錄子參與能量代謝；二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)都顯示Lj-Grimin具有細(xì)胞凋亡因子GRIM19基因家族的標(biāo)志性特征,并且在進(jìn)化上高度保守；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)到Lj-Grimin

8、廣泛分布于日本七鰓鰻各組織之中,且在心臟和紅細(xì)胞中表達(dá)量最高。同時(shí),病原菌刺激后在心臟中表達(dá)量明顯上調(diào),提示Lj-Grimin在日本七鰓鰻的生活史中起關(guān)鍵作用,并參與病原菌引發(fā)的的免疫防御反應(yīng)。
　　 日本七鰓鰻唾液腺分泌蛋白的組分分析與鑒定,從蛋白和基因兩個(gè)水平上完善了日本七鰓鰻唾液腺分泌蛋白的組成信息,有助于我們深入了解日本七鰓鰻特殊的生活習(xí)性及其特殊的進(jìn)化地位,并為深入研究日本七鰓鰻唾液腺分泌的功能基因和蛋白質(zhì)組學(xué)提供了理