重組牛朊病毒和人粒細(xì)胞集落刺激因子的色譜復(fù)性并同時(shí)純化.pdf

1、基因重組蛋白的復(fù)性是生物工程下游技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵問題，因長期未能得到很好的解決，從而在很大程度上制約著生物工程產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化。用液相色譜(LC)進(jìn)行變性蛋白復(fù)性是近年來迅速發(fā)展起來的一種新的方法，它能夠顯著地提高蛋白復(fù)性效率，并同時(shí)使目標(biāo)蛋白得到純化，目前已成為國際上的研究熱點(diǎn)。本論文應(yīng)用LC對(duì)兩種重組蛋白，重組牛朊病毒蛋白片斷[rbPrP(104-242)]和重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)進(jìn)行了復(fù)性并同時(shí)純化，同時(shí)還對(duì)rhG

2、-CSF的復(fù)性并同時(shí)純化工藝進(jìn)行了放大。 論文包括以下八個(gè)部分：1.文獻(xiàn)綜述：簡要地介紹了蛋白質(zhì)復(fù)性的意義，對(duì)近年來發(fā)展起來的蛋白質(zhì)復(fù)性新方法進(jìn)行了系統(tǒng)的綜述。也對(duì)朊病毒和rhG-CSF的復(fù)性及分離純化研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。引用文獻(xiàn)200篇。 2.用高效疏水色譜(HPHIC)對(duì)大腸桿菌(E.coli)表達(dá)的重組牛朊病毒蛋白片斷rbPrP(104-242)進(jìn)行了純化，研究了pH值、固定相和鹽種類、梯度模式等幾種因素對(duì)純化

3、結(jié)果的影響。經(jīng)一步HPHIC，在40min內(nèi)可以得到純度為96％，質(zhì)量回收率為87％的rbPrP(104-242)，該方法簡單高效。圓二色性光譜結(jié)果表明所得rbPrP(104-242)的二級(jí)結(jié)構(gòu)正確。因此，rbPrP(104-242)可以在HPHIC過程中得到純化并同時(shí)復(fù)性。 3.成功地用普通SEC對(duì)E.coli表達(dá)的rhG-CSF進(jìn)行了復(fù)性并進(jìn)行了部分純化，研究了流動(dòng)相中脲濃度、流動(dòng)相pH、流速、谷胱甘肽濃度和氧化還原比例，

4、以及甘油濃度等因素對(duì)rhG-CSF的SEC復(fù)性的影響。在優(yōu)化的條件下，所得rhG-CSF的比活為1.2×108IU·mg-1，其質(zhì)量回收率為30.1％，所用時(shí)間為25min。采用脲梯度SEC對(duì)rhG-CSF進(jìn)行了復(fù)性，研究了脲梯度的長度和最終的脲濃度對(duì)rhG-CSF復(fù)性的影響。與普通SEC相比，在流動(dòng)相中有脲存在并用脲梯度是一種更有效的SEC復(fù)性rhG-CSF的方法，能夠更好地抑制復(fù)性過程中聚集體的產(chǎn)生，所得rhG-CSF的比活為1.2

5、×108IU·mg-1，純度為82.1％質(zhì)量回收率為52.8％，所用時(shí)間為30min。 4.采用強(qiáng)陰離子交換色譜(SAX)法成功地對(duì)8.0mol·L-1脲變性的rhG-CSF進(jìn)行了復(fù)性并同時(shí)純化，考察了流動(dòng)相中脲濃度、流動(dòng)相的pH值、流速、氧化還原對(duì)比例等對(duì)SAX復(fù)性rhG-CSF的影響。在優(yōu)化的條件下，所得rhG-CSF的比活性()為3.0×108IU·mg-1，純度為96.4％，質(zhì)量回收率為49.3％，所用時(shí)間為30min

6、。而采用稀釋法所得rhG-CSF的比活性為0.93×108IU·mg-1，質(zhì)量回收率為32.7％，所用時(shí)間為9h。與稀釋法相比，SAX不但具有較高的復(fù)性效率，而且省略了通常稀釋復(fù)性方法中的稀釋、離心除沉淀、濃縮和上樣等步驟。 5.將弱陰離子交換(WAX)色譜餅用于rhG-CSF的復(fù)性并同時(shí)純化，該法可在進(jìn)樣時(shí)生成沉淀的條件下正常進(jìn)行色譜操作。研究了流動(dòng)相中脲濃度、鹽種類、緩沖液、流動(dòng)相的pH值、流速、氧化還原對(duì)濃度比例等對(duì)WA

7、X色譜餅對(duì)rhG-CSF復(fù)性的影響。在此條件下，所得rhG-CSF的比活性為1.9×108IU·mg-1，純度為95.8％，質(zhì)量回收率為29.4％，所用時(shí)間為25min。 6.將固定化金屬離子親合色譜(IMAC)用于rhG-CSF的復(fù)性并同時(shí)純化，研究了流動(dòng)相中脲濃度、流動(dòng)相pH、緩沖液種類和甘油濃度對(duì)rhG-CSF復(fù)性的影響。在優(yōu)化的條件下，所得rhG-CSF的比活性為2.3×108IU·mg-1，純度為98.2％，質(zhì)量回收

8、率為36.4％，所用時(shí)間為40min。而稀釋法所得rhG-CSF的比活性僅為0.81×108IU·mg-1，質(zhì)量回收率為27.2％，所用時(shí)間為9h。這也是首次將IMAC用于非融合蛋白的復(fù)性。 7.用HPHIC對(duì)8.0mol·L-1脲溶解的rhG-CSF進(jìn)行了復(fù)性，研究了鹽種類、硫酸銨濃度、緩沖液種類、流動(dòng)相pH值、流速和固定相等對(duì)rhG-CSF復(fù)性的影響。在優(yōu)化的條件下，經(jīng)一步HPHIC后，在28min內(nèi)rhG-CSF可以得到

9、復(fù)性，并同時(shí)得到純化，其比活為2.1×108IUmg-1，純度為96.8％，復(fù)性及純化過程中的質(zhì)量回收率為42.6％，所用時(shí)間為23min。該工藝成本低，操作周期短，容易放大，可應(yīng)用于rhG-CSF的大規(guī)模生產(chǎn)。 8.對(duì)HPHIC復(fù)性rhG-CSF的工藝進(jìn)行了放大，用10×200mmI.D.HPHIC色譜餅在工業(yè)規(guī)模上對(duì)rhG-CSF進(jìn)行了復(fù)性并同時(shí)純化，研究了流速、起始硫酸銨濃度、梯度時(shí)間和進(jìn)樣方式等對(duì)復(fù)性過程的影響。10×

10、200mmI.D.HPHIC色譜餅基本上可以負(fù)載體積為200mL，總蛋白含量約為1.6g的rhG-CSF的8.0mol·L-1脲提取液。在此條件下，所得rhG-CSF的比活為2.3×108IU·mg-1，純度大于95.4％，質(zhì)量回收率為36.9％，所用時(shí)間為140min。 本論文的研究結(jié)果表明，對(duì)rbPrP(104-242)，HPHIC效果甚佳。對(duì)幾種折疊液相色譜法用于含二硫鍵的重組蛋白rhG-CSF的復(fù)性并同時(shí)純化而言，用S

11、AX、WAX、IMAC和HPHIC復(fù)性rhG-CSF時(shí)，所得復(fù)性率均高于稀釋法和SEC法，其中以SAX法所得結(jié)果最好，但因其所用基質(zhì)為軟基質(zhì)，流速不宜太大，用于工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，耗時(shí)太長。用HPHIC法雖然質(zhì)量回收率低于脲梯度SEC法，且與SAX法相當(dāng)，但HPHIC色譜餅法容易工業(yè)放大。另外，在用LC法進(jìn)行復(fù)性時(shí)，均不可避免地會(huì)產(chǎn)生蛋白沉淀，沉淀積累后就會(huì)使柱壓急劇升高，甚至?xí)⑸V柱堵塞，使LC復(fù)性過程不能正常進(jìn)行。而HPHIC色譜餅法可在