新穎水解酶CESH的催化機(jī)制及其高效催化工藝研究.pdf

1、順式環(huán)氧琥珀酸水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase，CESH)，是一種水解酶，能催化順式環(huán)氧琥珀酸水解為酒石酸。酒石酸廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、紡織、電鍍等行業(yè)，其需求量正在逐年遞增，目前利用具有立體選擇特異性的微生物來源CESH生產(chǎn)酒石酸已逐步成為酒石酸生產(chǎn)技術(shù)的新發(fā)展方向。本文概述了酒石酸和CESH的研究進(jìn)展，并研究了新穎水解酶CESH的催化機(jī)制及其高效催化工藝。
　　 從田園土中篩選到一株產(chǎn)新

2、穎CESH的野生菌，它能將順式環(huán)氧琥珀酸立體特異性的轉(zhuǎn)化為D(-)-酒石酸，經(jīng)鑒定為博德特氏菌屬(Bordetella)，并命名為Bordetellasp.BK-52。對該野生菌產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，最高酶活達(dá)764 U/g。隨后我們從該野生菌中分離純化得到CESH，酶學(xué)性質(zhì)研究顯示，該酶具有溫度穩(wěn)定性好、pH穩(wěn)定性范圍廣，金屬離子耐受性好，立體特異性高等特點(diǎn)，表明該酶很適合作為工業(yè)生物催化劑。此外，我們還首次獲得Bordetella sp

3、.CESH的基因序列(GenBank登錄號為EU053208)。
　　 根據(jù)上述CESH基因序列，構(gòu)建基因工程菌，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了CESH在大腸桿菌中的表達(dá)條件，使工程菌的酶活達(dá)到40129 U/g，為野生菌的53倍。隨后從12種細(xì)胞固定化方法中篩選到κ-卡拉膠包埋法，通過響應(yīng)面法優(yōu)化其固定化條件，使固定化工程菌細(xì)胞的酶活回收率達(dá)83％。該固定化細(xì)胞對溫度、pH、金屬離子、表面活性劑等多種外界條件具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，連續(xù)使用10

4、批后，殘余活力仍為93％，顯示出良好的工業(yè)應(yīng)用潛能與前景。
　　 紅球菌(Rhodococcus opacus)CESH可催化順式環(huán)氧琥珀酸生成L(+)-酒石酸。序列比對和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示，該CESH屬于鹵烷基脫鹵酶超家族成員，29個(gè)保守位點(diǎn)的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)、圓二色譜分析、立體特異性分析和酶學(xué)性質(zhì)分析證實(shí)，下列9個(gè)氨基酸在該酶催化過程中起重要作用：Asp18、Asp193、Arg55、Lys164、His190、Thr22、T

5、yr170、Asn134和Ala188。同位素H218O標(biāo)記的單轉(zhuǎn)化和多轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明，在水解過程中，水分子中的O原子首先轉(zhuǎn)移到酶中，然后再轉(zhuǎn)移到產(chǎn)物中。接著預(yù)測了Rhodococcus opacus CESH的三維結(jié)構(gòu)，整體三維結(jié)構(gòu)和重要活性位點(diǎn)的重疊結(jié)果顯示，該酶與一些三維結(jié)構(gòu)已知的鹵烷基脫鹵酶(Hd1、L-DEX和Dh1B)的結(jié)構(gòu)非常相似，采用兩步法的催化機(jī)制，并推測該催化機(jī)制通過催化三聯(lián)體Asp18-His190-Asp193進(jìn)行