黃孢原毛平革菌胞外低分子物質(zhì)在木素降解過程中作用的研究.pdf

1、木素是自然界中含量最豐富的可再生性有機(jī)資源之一，其生物降解構(gòu)成自然界碳素循環(huán)的限速步驟。真菌中的白腐菌類具有完整的木素降解體系，能將木素徹底氧化性降解為CO<,2>和H<,2>O。黃孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)作為一模式菌株，得到深入研究。木素過氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)和錳過氧化物酶(manganese peroxidase，MnP)就是最早從此菌中發(fā)現(xiàn)的，并由此作為

2、一個(gè)新的起點(diǎn)，推動(dòng)了白腐菌酶學(xué)領(lǐng)域的深入發(fā)展。但由于木素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，至今其生物降解機(jī)制仍未闡明，各類木素降解酶在胞外都難以實(shí)現(xiàn)對(duì)天然木素的徹底降解；免疫標(biāo)記研究證明，LiP和MnP等大分子酶蛋白并不能直接穿過完整木材的微孔結(jié)構(gòu)，進(jìn)入細(xì)胞壁以啟動(dòng)木素的降解。這些研究對(duì)已發(fā)現(xiàn)的木素降解酶在天然木素降解中的作用提出了疑問，并啟發(fā)人們推測可能有多種低分子活性物質(zhì)和木素降解酶協(xié)同參與木素生物降解，因而活性低分子物質(zhì)在木素、纖維素降解中的作用成為一個(gè)

3、新的研究熱點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)的參與木素降解的低分子物質(zhì)除O<,2>和H<,2>O<,2>外，主要有羥基自由基／鐵離子、活性氧基(reactive oxygen species，ROS)、藜蘆醇(veratryl alcohol，VA)、草酸等小分子有機(jī)酸／錳離子、3-羥基鄰氨基苯甲酸(3-hydroxyanthranilic acid，3-HAA)等，但迄今為止，關(guān)于它們?cè)谀舅厣锝到膺^程中的作用都是推測。 早在1996年，本實(shí)驗(yàn)室即

4、發(fā)現(xiàn)木霉中的低分子肽類具有氧化性降解纖維素的能力，此后由褐腐真菌中分離純化到具有類似功能的小肽Gt factor，本研究工作是上述工作的深入。本論文以P. chrysosprium胞外培養(yǎng)液中分子量5000 Da以下的低分子系統(tǒng)為研究對(duì)象，細(xì)致而全面地考察了P.chrysosprium胞外低分子系統(tǒng)的性質(zhì)，通過一系列分離純化步驟，從其中獲得三種新型低分子量物質(zhì)，分別命名為Pcfactor(Pc因子)、Pc reducer(Pc還原因子)

5、和MnP promoter(MnP促進(jìn)因子)。這三種低分子物質(zhì)功能各具特色，Pc factor具有酚氧化活性，Pc reducer具有還原某些自由基的性質(zhì)，MnP promoter則具有促進(jìn)MnP活力的功能，采用紫外可見光譜(UV-Vis)、紅外光譜(FT-IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)、電子自旋共振(ESR)等方法探索了其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，研究了它們?cè)谀舅厣锝到庵械淖饔?，并進(jìn)一步做了組建胞外可連續(xù)降解木素的氧化還原體系的探索，取

6、得了初步結(jié)果。本研究豐富了人們對(duì)白腐菌胞外低分子系統(tǒng)在組成、功能等方面的認(rèn)識(shí)，并在檢測方法和木素降解研究思路上做了積極的探索。 本論文的主要研究結(jié)果如下： 一、從P.chrysosprium胞外培養(yǎng)液中分離到三種新型低分子量組分，它們的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)各具特色，根據(jù)來源或性質(zhì)，分別命名為Pc factor、Pc reducer和MnP promoter 1、具有類似漆酶活性的低分子量組分Pc factor 從P

7、.chrysosprium的培養(yǎng)液中分離到一個(gè)新的具有酚氧化活性的低分子量組分，命名為Pc factor(Pc因子)。Pc factor能夠直接氧化酚型木素模型物，如2,6-二甲氧基酚(2,6-dimethoxyphenol，2,6-DMP)，2,2’-連氮二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(2，2’-azinobis(3-ethylbenzathiazoline-6-sulfinic acid)，ABTS)和丁香醛連氮等，不需要Mn<'

8、2+>和．H<,2>O<,2>的參與。Pc factor與2,6-DMP反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)如圖1所示： Time(sec) Fig.l Reaction process Of 2,6-DMP oxidized by Pc factor and fitting data by sigmoidal equation Pc factor與2,6-DMP反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)符合S型曲線模式，反應(yīng)速率上升很快，可迅速到達(dá)飽合值，適

9、合用Sigmoidal does-response (variable slope)方程擬合。這與MnP和2,6-DMP的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)明顯不同(MnP的v-t曲線為線性，符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模式)。這一動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)表明在沒有新的電子供體和受體存在的條件下，Pc factor氧化能力不能持續(xù)進(jìn)行，表現(xiàn)為一個(gè)電子傳遞體的特征。該物質(zhì)對(duì)熱穩(wěn)定，在酸性條件下易失活，弱堿性條件下保持穩(wěn)定，它具有螯合Fe<'3+>的能力，并能夠?qū)e<'3+>還原為

10、Fe<'2+>，但不能產(chǎn)生羥基自由基HO'。其氧化作用需要金屬離子和O<,2>的參與，為木素生物降解過程中的一類新的氧化機(jī)制，表明Pc factor在此氧化還原體系中可能執(zhí)行電子傳遞體的功能。Pc factor的發(fā)現(xiàn)和作為木素氧化性降解過程中的一個(gè)電子傳遞體的深入研究，對(duì)解決木素生物降解這一難點(diǎn)可望產(chǎn)生一定的影響。 經(jīng)HPLC凝膠過濾測定Pc factor的分子量大約在600 Da，左右，其氨基酸組成分析表明，Pc factor

11、含有Glu，Gly和Val三種氨基酸，其紫外和紅外光譜也顯示Pc factor含有氨基酸，氨基酸的Ca信號(hào)在<'13>C-NMR方法中也可檢測到。但Pc factor的質(zhì)譜分析未得到分子離子峰，其碎裂片斷表明還存在其它未知結(jié)構(gòu)。初步推斷Pc factor應(yīng)屬于多肽類物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)需要更深入的分析和測定。 2、具有還原自由基能力的低分子組分Pcreducer 木素生物降解過程不是單純的氧化反應(yīng)，其中必然涉及到還原反應(yīng)，纖

12、維二糖脫氫酶因其還原性能而備受關(guān)注。從P.chrysosprium胞外培養(yǎng)液中首次分離到具有還原自由基能力的低分子量組分，命名為Pc reducer(Pc還原因子)。該物質(zhì)具有明顯的還原特性，用硫代巴比妥酸(Thiobarburic acid，TBA)方法檢測能夠還原羥基自由基的能力，并采用電子自旋共振技術(shù)(ESR)進(jìn)一步證實(shí)(圖2)。在一定條件下，此物質(zhì)也可以還原穩(wěn)定的氮氧自由基如4-maleimideo-TEMPO。Pc reduc

13、er能夠緩解過氧化物酶氧化酚類物質(zhì)引起的聚合反應(yīng)，并影響LiP和MnP的活力。該物質(zhì)對(duì)熱穩(wěn)定，但在空氣中可以被氧氣緩慢氧化，且具有螯合Fe<'3+>的能力，并能夠?qū)e<'3+>還原為Fe<'2+>。Pc reducer的還原特性可能為一類新的還原途徑和機(jī)制，在木素生物降解的還原過程中起到重要作用。 MALDI-TOF和ESI／MS質(zhì)譜結(jié)果顯示Pc：reducer分子量為1017 Da，且具有分子量為ll3Da的結(jié)構(gòu)單元，元素分

14、析表明為一含氮化合物，但其氨基酸組成分析說明Pcreducer不含氨基酸。紅外光譜的解析圖譜可見明顯的N．H信號(hào)、酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺Ⅲ帶，NMR譜結(jié)果顯示可能含有的結(jié)構(gòu)，推斷Pcreducer屬于聚酰胺類物質(zhì)，其具體結(jié)構(gòu)有待于進(jìn)一步研究。 3、具有促進(jìn)錳過氧化物酶活力的低分子組分MnPpromoter 經(jīng)檢測，在迄今已知的所有木素降解真菌的胞外酶液中都有MnP。由于已知某些 可降解天然木素的菌類不分泌LiP，黃

15、孢原毛平革菌的LiP缺陷株也降解天然木素，因此，MnP在木素降解中的關(guān)鍵作用日益獲得共識(shí)。 從P.chrysosprium發(fā)酵液中通過一系列純化步驟得到具有促進(jìn)MnP活力的低分子組分，命名為MnP promoter(MnP促進(jìn)因子)。該物質(zhì)對(duì)熱比較穩(wěn)定，能夠促進(jìn)MnP活力，其機(jī)理可能是通過螯合Mn<'3+>，形成氧化還原電勢較高的穩(wěn)定的復(fù)合物。由于條件限制，目前尚未檢測到它擴(kuò)大MnP的底物范圍，從而氧化非酚型結(jié)構(gòu)；它具有螯合Fe

16、<'3+>的能力，并能夠?qū)e<'3+>還原為：Fe<'2+>。對(duì)其深入研究將對(duì)明確木素天然降解中MnP的定位和闡明木素的生物降解機(jī)制具有重要意義。<'3+> 該組分分子量1389 Da，其質(zhì)譜和核磁結(jié)果顯示可能是由分子量為98 Da的結(jié)構(gòu)單元組成，不含氨基酸殘基，其紫外可見光譜分析可見在260 nl／1左右有較明顯的特征吸收，可能由五元或六元環(huán)的大π共軛結(jié)構(gòu)引起的，初步推斷MnP promoter屬于聚合雜環(huán)類物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)尚待深入

17、研究和測定。 二、根據(jù)Pcfactor和Pcreducer的性質(zhì)提出體外組建可持續(xù)性木素降解的氧化體系的思路，并進(jìn)行初步探索。 生物體系中涉及能量產(chǎn)生的氧化還原作用，都是由電子傳遞鏈來進(jìn)行的，由NADH到分子氧經(jīng)過多個(gè)電子傳遞體，逐步傳遞電子，應(yīng)為一共同的規(guī)律。但是，目前尚未把這種認(rèn)識(shí)應(yīng)用在木素氧化性降解研究中。沿用常規(guī)的酶學(xué)研究方法，木素生物降解機(jī)理研究進(jìn)展緩慢。我們提出根據(jù)Pc factor和Pc reducer的性