肋軟骨膜、肋軟骨和骨髓來源間充質干細胞的比較.pdf

1、由于間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)來源的多樣性、體外誘導的多向分化性，沒有特定的表面表記等特點，對其起源有不同的觀點。學者們多認為MSCs是存在于組織和器官中的成體干細胞經體外培養(yǎng)擴增而成。但Orkin等提出：體內也可能不存在MSCs，只是在體外培養(yǎng)分離到的細胞時，這些細胞被激發(fā)轉變或者基因重編，成為具有干細胞特性的細胞。成熟的細胞能否轉化成干細胞呢?已有報道從軟骨中分離到干細胞，但體內僅生長區(qū)外

2、的軟骨組織中無干細胞，關節(jié)軟骨也有干細胞。從軟骨中分離到的干細胞是來自軟骨中的干細胞還是由軟骨細胞轉化而成的呢?本實驗擬分別從兔非生長區(qū)肋軟骨膜、肋軟骨和骨髓中分離、培養(yǎng)、擴增獲得干細胞，觀察軟骨細胞能否轉化為干細胞?幾種來源干細胞的差異?有助于認識成體干細胞體外分離獲取的機制，以及干細胞臨床應用研究的基礎理論。
　　第一部分兔肋軟骨膜、肋軟骨和骨髓來源干細胞的分離培養(yǎng)
　　1材料與方法
　　取3-4周新西蘭大白兔的肋

3、軟骨(避開肋生長板區(qū))，解剖顯微鏡下剝離軟骨膜，肋軟骨和肋軟骨膜均經酶消化法分別獲取肋軟骨和肋軟骨膜細胞；另取股骨、脛骨的骨髓細胞。三種來源的細胞均以貼壁法分離、培養(yǎng)、擴增，分別獲得3種來源的干細胞。觀察3者各代細胞的形態(tài)和生長。
　　取三種來源的第3代細胞，以1×104個細胞接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每天隨機各取3個培養(yǎng)孔，共10天，計數細胞數，繪制生長曲線。
　　2結果
　　從肋軟骨膜中分離的原代細胞接種12h后開

4、始貼壁，5-6 d細胞融合，聚集成團，以圓形和多邊形為主，從第2代開始細胞形態(tài)均一，以梭形為主，呈漩渦狀排列。目前己傳至15代。從肋軟骨中分離的原代細胞6h后開始貼壁，5-6天細胞融合，以鋪路石形態(tài)為主，第2代和第3代細胞逐漸轉變成梭形；但第5代出現細胞老化，只傳至第6代。原代骨髓細胞培養(yǎng)4-5h后開始貼壁，10d左右細胞融合。融合時細胞可見梭形，第2代以后細胞形態(tài)以梭形為主，呈明顯漩渦狀排列，已傳10代，生長良好。
　　三種來源

5、細胞第3代細胞的生長曲線表明：貼壁后生長潛伏適應期為1-3 d；3 d后即進入對數生長期；6 d后進入生長平臺期。
　　第二部分肋軟骨膜、肋軟骨和骨髓來源干細胞的比較
　　1材料與方法
　　1.1三種來源的每一代細胞均以免疫組化染色方法檢測每一代細胞CD29、CD90、CD34和Ⅱ型膠原的表達。
　　1.2取三種來源的第3代干細胞分別進行體外成脂誘導14天、成骨誘導21天；油紅0和硝酸銀染色法檢測比較三種干細胞成

6、脂、成骨的分化能力。
　　2結果
　　2.1免疫細胞化學染色發(fā)觀原代及第1代肋軟骨膜和肋軟骨細胞均不表達CD29、CD90、CD34，從第2代細胞開始表達CD29、CD90，仍不表達CD34。原代骨髓細胞可表達CD29、CD90和CD34，不表達Ⅱ型膠原；隨后只表達CD29和CD90。三種來源的第3代細胞均只強表達CD29、CD90，其均一性都達到99％以上。作為軟骨細胞標記物之一的Ⅱ型膠原，僅原代及第1代肋軟骨細胞表達，從

7、第2代細胞不再表達。
　　2.2三種來源的第3代干細胞經成脂誘導14天后，肋軟骨膜和骨髓來源的干細胞形狀多由梭形轉變?yōu)閳A形，肋軟骨來源的干細胞則逐漸轉變?yōu)殚L梭形，細胞內均可見油紅O染色的紅色小脂滴。成骨誘導21天后，肋軟骨膜和肋軟骨來源的干細胞呈復層生長，而骨髓來源的干細胞成單層生長。經過硝酸銀染色后，黑色鈣化小結節(jié)分散于肋軟骨膜和肋軟骨來源的干細胞表面；骨髓來源的干細胞表面的骨結節(jié)則聚集成團。
　　全文結論
　　1.

8、用酶消化法，成功的分離、培養(yǎng)和擴增了兔肋軟骨膜和肋軟骨來源的干細胞。用貼壁法提取了骨髓細胞。體外多次傳代后，肋軟骨膜和骨髓來源的干細胞比肋軟骨來源的干細胞具有更強的生長增殖能力。
　　2.免疫組化檢測顯示肋軟骨膜和肋軟骨細胞從第2代開始均表達MSCs的表型，至第三代強表達。表明這兩種細胞第3代具有MSCs的表型特征。
　　3.肋軟骨膜和肋軟骨來源的第3代干細胞在體外經誘導后具有與BMSCs一致的成脂和成骨能力，證明這兩種來源