改變PTEN基因的表達對人氣道平滑肌遷移的影響.pdf

1、背景：支氣管哮喘(Bronchial asthma,asthma)是由多種細胞和細胞成分參與的氣道慢性炎癥疾患.這種慢性炎癥導致氣道高反應性,通常出現廣泛多變的可逆性氣流受限。如果哮喘持續(xù)發(fā)展,氣流受限可變?yōu)椴糠挚赡?。目前認為,這與氣道重塑的發(fā)生有關。氣道壁重塑伴有氣道上皮增生、上皮下纖維肌化、氣道平滑肌增生、微血管發(fā)生和腺體的肥大等結構改變。各種炎癥介質及炎癥細胞對氣管反復損傷和機體對損傷性刺激的修復性反應引起的氣管發(fā)生改變,組織結構

2、重構。眾所周知,氣道平滑肌細胞(Human airway smooth muscle cell,HASMC)在哮喘氣道重塑中發(fā)揮著重要的作用,被認為是哮喘氣道重塑的關鍵細胞。當前的哮喘治療藥物,主要作用于慢性氣道炎癥,而氣道重塑未給予足夠重視。目前,抑制和減緩氣道重塑成為一個新的研究方向,因此越來越多學者將HASMC作為抑制和減緩氣道重塑的新靶點。
　　 第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(phosphatase a

3、ndtension homologue deleted on chromosome ten,PTEN)是迄今為止發(fā)現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因,定位于10q23.3,由9個外顯子組成,編碼由403個氨基酸組成的蛋白。研究表明,PTEN在等子宮內膜癌、卵巢癌、大腸癌等多種腫瘤發(fā)生中起重要作用。近年來隨著研究深入,發(fā)現PTEN對非腫瘤疾病如:心肌肥大,高血壓動脈粥樣硬化,支氣管哮喘哮等疾病中也發(fā)揮重要的作用。PTEN可以通過阻斷磷脂酞

4、肌醇-3-激酶信號傳導通路(PI3K/PKB/AKT信號通路)及絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號傳導通路(Ras-Raf-MEKI/2-ERKI/2信號通路)等抑制腫瘤細胞、心肌和血管內皮等細胞的增殖、遷移,促進細胞的凋亡。
　　 在致死性及非致死性哮喘中可見明顯平滑肌細胞增生、肥大和平滑肌向氣道上皮、內膜的遷移發(fā)生,這在氣道重塑中起了重要的作用,使氣道壁增厚,導致基礎氣道阻力增加和不可逆性氣流阻塞的發(fā)生。這些都間接證明HA

5、SMC具有遷移的功能。雖然目前還缺乏HASMC向氣道內膜直接遷移的證據,但有研究發(fā)現,在哮喘患者氣道活檢組織標本中,氣道固有層內發(fā)現的肌纖維母細胞在顯微結構、形態(tài)學和位置方面都與HASMC極其相似,提示肌纖維母細胞可能是HASMC遷移并轉化而來。這種遷移與動脈粥樣硬化時血管平滑肌細胞(Vascularsmooth muscle cell,VSMC)的遷移相類似。而且有文獻表明,PTEN的過表達能抑制基礎和PDGF誘導的VSMC的增殖,遷

6、移和存活。因此我們推理:PTEN可能對HASMC的增殖、遷移等的主要信號傳導通路有類似地影響。本實驗主要側重于改變表達PTEN對HASMC遷移的影響。
　　 目的：通過攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的腺病毒載體體外轉染人氣道平滑肌細胞(Human airway smooth muscle cell,HASMC),使腫瘤抑制基因PTEN的過表達和RNA干擾表達,并以空載腺病毒(Ad-GFP)及空白組(DMEM)作為陰性對照,觀察其對H

7、ASMC遷移的影響,并探討其作用機制。
　　 材料與方法：
　　 1、取南方醫(yī)院胸外科同期做肺葉切除術患者的正常肺葉、段支氣管標本,(經患者及家屬同意)組織塊貼壁法培養(yǎng)人支氣管平滑肌細胞(HASMC),取第3-8代細胞,進行實驗。光鏡下觀察和細胞免疫組化(α-actin)進行HASMC鑒定.
　　 2、實驗分為四組:(1)利用攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒(Ad-GFP-PrEN)轉染HASMC,實現PTEN

8、的過表達；(2)針對PTEN基因的腺病毒短發(fā)夾狀RNA(shRNA)載體(Ad-GFP-shRNA-PTEN)轉染HASMC,實現PTEN的干擾表達；(3)以感染空載腺病毒(Ad-GFP)轉染HASMC；(4)只加入無血清培養(yǎng)基的空白組(DMEM)作為對照。重組腺病毒感染HASMC:選擇處于對數生長期的HASMC,加入用無血清的DMEM稀釋的病毒液,置于37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育,4h后補加含有血清的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育2

9、4h后,更換完全培養(yǎng)基,通過在倒置熒光顯微鏡下觀察病毒轉染效果。并用流式細胞計數確立最佳轉染復數(MOI,multiplicity of infection)。
　　 3、通過Transwell趨化小室和細胞劃痕試驗(Wound healing assay)檢測四組(Ad-GFP-PTEN、Ad-GFP-shRNA-PTEN、Ad-GFP、DMEM)HASMC的跨膜遷移能力和橫向遷移能力的變化。其中劃痕實驗測量HASMC距離應用

10、圖像處理軟件Image J.
　　 4、Western blot法檢測PTEN蛋白的表達和AKT、ERK1/2通路的活化情況,檢測相應信號通路在細胞遷移中的蛋白表達的改變,并探討其作用。并加入兩通路的抑制劑(LY294002、U0126)作為陽性對照。
　　 5、應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數據統(tǒng)計分析,用x±s對資料進行描述,用單因素方差分析進行統(tǒng)計處理,組間比較采用LSD法。如果方差不齊,應用方差近似檢驗,組件比

11、較用Dunnett's T3檢驗。選取檢驗水準α=0.05。圖片處理使用Image J軟件。
　　 結果：
　　 1、應用倒置相差顯微鏡觀察,HASMCs未匯合之前多呈梭形或多邊形,內有1～2個細胞核。細胞匯合后部分區(qū)域細胞束狀排列,呈典型“峰、谷”狀。細胞免疫組化法檢測平滑肌細胞表型標志物α-actin,光鏡下可見α-肌動蛋白(棕黃色顆粒)在胞質內均勻分布。
　　 2、用空載病毒載體Ad-GFP轉染HASMC,

12、在25、50、100、150、200不同MOI條件下,24小時流式檢測的轉染效率在70％-99％之間,當MOI≥100時轉染效率達到95％以上,趨于穩(wěn)定。因此確定最佳感染復數為MOI=100。各組腺病毒均以MOI=100轉染HASMC,48h后倒置顯微鏡下觀察,陽性細胞的綠色熒光蛋白GFP表達滿視野。
　　 3、Western blot免疫印跡法法檢測PTEN蛋白的表達:轉染Ad-GFP-shRNA-PTEN后,干擾組PTEN基

13、因表達減弱；轉染Ad-GFP-PTEN后,過表達組PTEN基因表達明顯增強；而陰性對照組和空白對照組,PTEN基因的表達無明顯變化。
　　 4、Western blot免疫印跡法法檢測AKT、ERK蛋白的表達:與對照組相比,Ad-shPTEN組細胞p-AKT表達明顯增高,而Ad-PTEN組細胞p-AKT的表達減少,p-AKT抑制劑LY294002作為抑制p-AKT的陽性對照,五組總AKT表達無明顯差異:與對照組相比Ad-shPT

14、EN組細胞p-ERK表達降低,但Ad-PTEN組p-ERK表達無明顯變化,p-ERK抑制劑U0126作為抑制p-ERK的陽性對照,五組總ERK表達無明顯差異。
　　 5、Transwell趨化小室法證明與空白對照組(DMEM)(393.78±28.46)和陰性對照組(Ad-GFP)(395.78±51.50)相比過表達組(Ad-PTEN)(147.89±32.83)能顯著抑制HASMC的遷移活動(P=0.000)；而干擾組(Ad

15、-shPTEN)(405.33±81.74)與兩對照組(Ad-GFP、DMEM)相比細胞遷移活動沒有顯著增加,無統(tǒng)計學意義(P=1.000)；陰性對照組(Ad-GFP)與空白對照組(DMEM)兩者相比,差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)；PDK/AKT通路抑制劑組(LY294002)(70.56±12.95)作為抑制HASMC遷移的陽性對照組與其他4組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000):劃痕修復法的實驗結果與transwell法基本相同

16、,再次印證了與兩對照組相比,Ad-PTEN組(121.76±20.66)能抑制HASMC的遷移(P=0.000),而Ad-shPTEN組(236.47±55.14)細胞遷移活動沒有顯著增加(P=0.564vsAd-GFP,P=0.229vsDMEM)而Ad-GFP組(225.79±29.52)與DMEM組(258.88±55.06)沒有顯著性差異(P=0.079),LY294002(81.17±14.40)組作為抑制HASMC遷移的陽性

17、對照組與其他4組有顯著性差異(P=0.000vsAd-shPTEN&Ad-GFP&DMEM,P=0.033vsAd-PIEN)結論本文通過腺病毒介導轉染HASMC,使抑癌基因PTEN在細胞實現的過表達和干擾表達,探討PTEN對HASMC的遷移的影響,并討論其分子信號的轉導通路。
　　 結論:
　　 1、本實驗用transwell法和劃痕法檢測細胞的遷移結果表明,與兩對照組相比Ad-PTEN組細胞的遷移也受到了明顯的抑制,