靶向沉默MT1-MMP基因?qū)ρ芷交〖?xì)胞遷移能力的影響.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：大鼠MT1-MMP短發(fā)卡RNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　 目的：構(gòu)建靶向大鼠膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MT1-MMP）的短發(fā)卡RNA（shRNA）真核表達(dá)載體質(zhì)粒，為利用RNA干擾技術(shù)抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞 MT1--MMP基因表達(dá)的研究做準(zhǔn)備。
　　 方法：根據(jù)大鼠MT1-MMP mRNA 序列(NM_031056)設(shè)計(jì)并合成shRNA 寡核苷酸片段，退火形成雙鏈并克隆進(jìn)入載體

2、 pGenesil--1，并進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序。
　　 結(jié)果：酶切證明構(gòu)建的shRNA 已插入載體，經(jīng)測(cè)序證明與設(shè)計(jì)的相同。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了大鼠真核表達(dá)質(zhì)粒重組體(pGenesiL-1-MT1-MMP)，為進(jìn)一步靶向大鼠血管平滑肌細(xì)胞MT1-MMP 行RNA干擾的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：大鼠血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
　　 目的:建立一種大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，為下一步的研

3、究提供實(shí)驗(yàn)材料。
　　 方法:采用組織貼塊法、胰酶消化法進(jìn)行細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)，綜合運(yùn)用自然純化、機(jī)械刮除、差異貼壁法進(jìn)行細(xì)胞純化，并應(yīng)用相差顯微鏡和平滑肌肌動(dòng)蛋白對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)和免疫組化鑒定。
　　 結(jié)果:90%的組織塊接種存活,第5 代的平滑肌細(xì)胞純度達(dá)98%以上。相差顯微鏡下培養(yǎng)細(xì)胞呈典型的“峰-谷狀”生長(zhǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示特異的α平滑肌肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性表達(dá)。
　　 結(jié)論:本法簡(jiǎn)便、可靠，培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞

4、純度高、性能好。可作為研究移植血管再狹窄良好的體外模型。
　　 第三部分：靶向沉默MT1-MMP對(duì)血管平滑肌細(xì)胞MT1-MMP基因表達(dá)的影響
　　 目的:探討pGenesiL-1-MT1-MMP對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）MT1-MMP基因mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)分為三組，空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組（加入pGenesiL-1-HK），RNAi組（加入pGenesiL-1-MT1-MMP）。

5、用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染VSMC 48h后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，于轉(zhuǎn)染后72 h 采用RT-PCR方法檢測(cè)MT1-MMP mRNA 水平，用Western blot方法檢測(cè)MT1-MMP 蛋白質(zhì)水平。
　　 結(jié)果:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染VSMC 48h后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率高達(dá)85.5%，轉(zhuǎn)染pGenesiL-1-MT1-MMP質(zhì)粒 72 h后，實(shí)驗(yàn)組MT1-MMP mRNA 及蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)(P<0.05)。
　　 結(jié)論:靶

6、向MT1-MMP的短發(fā)夾RNA 質(zhì)粒能夠高效地轉(zhuǎn)染入VSMC，并能有效下調(diào)MT1-MMP基因mRNA及其蛋白的表達(dá)。
　　 第四部分：靶向沉默MT1-MMP基因?qū)ρ芷交〖?xì)胞遷移能力的影響
　　 目的:探討靶向MT1-MMP的短發(fā)夾RNA 質(zhì)粒（pGenesiL-1-MT1-MMP）對(duì)大鼠VSMC 體外遷移能力的影響。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)分為三組，空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組（加入pGenesiL-1-HK），RNAi

7、組（加入pGenesiL-1-MT1-MMP）。用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染VSMC，用Transwell 侵襲小室模型和細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外遷移能力的變化，通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖能力，用Annexin V-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:轉(zhuǎn)染pGenesiL-1-MT1-MMP 質(zhì)粒后，VSMC的體外遷移能力明顯減弱(P<0.05)，細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞凋亡無(wú)明顯改變。
　　 結(jié)論:靶向MT1-MMP的短發(fā)夾RNA