NIRF泛素化p53作用過(guò)程中NIRF與p53結(jié)合域的測(cè)定.pdf

1、目的
　　Np95/ICBP90－like RING finger protein(NIRF)是新近發(fā)現(xiàn)的一種核蛋白，其包括802個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子內(nèi)部含有UBL(ubiquitin-like domain)、PHD、YDG/SRA和RING finger結(jié)構(gòu)域。隨著其研究的深入，NIRF功能已涉及細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、蛋白多聚泛素化降解、細(xì)胞癌變進(jìn)程控制以及更多未知的領(lǐng)域。已有研究報(bào)道，NIRF能與Cdk2－cvclin E復(fù)合體和

2、let-7a結(jié)合，過(guò)表達(dá)的NIRF能阻止細(xì)胞周期于G1期。另外NIRF還具有泛素化酶E3的作用，即泛素化和自我泛素化功能，表明NIRF介導(dǎo)重要的蛋白降解途徑。p53是細(xì)胞內(nèi)重要的抑癌基因，p53的功能活動(dòng)被認(rèn)為是細(xì)胞對(duì)細(xì)胞異常、損傷、壓力的一種應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)啟動(dòng)自我修復(fù)程序抑制細(xì)胞分裂誘導(dǎo)其進(jìn)入衰老程序，或啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡清除異變的細(xì)胞。已有研究報(bào)道NIRF能與p53相互作用，NIRF本身也是一個(gè)高度調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞正常的生理狀態(tài)下發(fā)

3、揮泛素化E3連接酶的作用結(jié)合p53并將其降解，但NIRF與p53結(jié)合的蛋白結(jié)合域目前尚不清楚。本文研究證明NIRF能與p53結(jié)合成復(fù)合體參與泛素化蛋白降解途徑，并測(cè)定出N1RF與p53結(jié)合的區(qū)域，為下一步研究蛋白泛素化降解和腫瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　方法
　　(1)采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細(xì)胞。培養(yǎng)基中補(bǔ)充含10％小牛血清和雙抗。
　　(2)RIPA蛋白裂解液收集HEK293細(xì)胞總蛋白。
　　

4、(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明說(shuō)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后收獲細(xì)胞，細(xì)胞收獲前10小時(shí)添加蛋白酶體抑制劑MG-132。
　　(4)將NIRF突變體在細(xì)胞內(nèi)全部表達(dá)。在HEK293細(xì)胞內(nèi)，分別轉(zhuǎn)染四個(gè)突變體質(zhì)粒，同時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV-3×FLAG空質(zhì)粒和pCMV-FLAG-NIRF全長(zhǎng)質(zhì)粒，作為陰陽(yáng)性對(duì)照.細(xì)胞裂解液經(jīng)Western印跡，anti-NIRF，anti-FLAG和anti-β-Actin抗體檢測(cè)分析。
　　(5)用免疫蛋

5、白共沉淀技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡分析技術(shù)鑒定NIRF與p53結(jié)合的蛋白結(jié)合域。HEK293細(xì)胞分別同時(shí)轉(zhuǎn)染p53和各突變體質(zhì)粒，細(xì)胞裂解液經(jīng)p53抗體IP純化，產(chǎn)物經(jīng)WB分析。NIRF全長(zhǎng)能與p53穩(wěn)定結(jié)合，同時(shí)轉(zhuǎn)染NIRF全長(zhǎng)質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。
　　結(jié)果
　　結(jié)果顯示，所有的突變體都能在細(xì)胞中表達(dá)，并且兩種抗體檢測(cè)結(jié)果完全一致。在免疫共沉淀試驗(yàn)中，△UBL、△YDG/SRA和△RING缺失突變體蛋白依然能被p53沉淀出，而△PHD