坐骨神經(jīng)預(yù)損傷通過miR-17-5p-STAT3-GAP-43通路促進初級感覺神經(jīng)元軸突再生的實驗研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在利用生物信息學(xué)技術(shù)在 miRNomes水平分析坐骨神經(jīng)預(yù)損傷（sciatic nerve conditioning injury，SNCI）促進脊髓后索損傷（dorsal column lesion， DCL）修復(fù)的分子生物學(xué)機制，并尋找其中起到關(guān)鍵調(diào)控作用的微小 RNA（microRNA，miRNA）。探究關(guān)鍵miRNA所調(diào)控的靶基因，并在細胞水平上對關(guān)鍵miRNA的表達進行調(diào)控，從而觀察所研究的關(guān)鍵miR

2、NA對大鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元軸突生長產(chǎn)生的影響。嘗試應(yīng)用β-苯乙基異硫氰酸酯（β-Phenylethyl isothiocyanate，PEITC）進行調(diào)控 DRG神經(jīng)元軸突的再生修復(fù)。
　　方法：
　　1.用microarray3.0芯片測定SNCI組、單純脊髓后索損傷（simple dorsal column lesion，SDCL）組和對照組大鼠DRG組織中的miRNA

3、表達譜，并通過生物信息學(xué)技術(shù)分析尋找在 SNCI促進 DCL修復(fù)過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用的miRNA。
　　2.應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)驗證芯片數(shù)據(jù)。并通過查詢miRBase數(shù)據(jù)庫和TargetScan數(shù)據(jù)庫，以及文獻檢索對所研究的關(guān)鍵miRNA的靶基因進行預(yù)測。
　　3.采用RT-qPCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)從mRNA水平和蛋白水平對所研究的關(guān)鍵miRNA的靶基因和靶蛋白進行驗證。
　　4.將出生24小時內(nèi)

4、的 Wistar大鼠的 DRG神經(jīng)元進行分離和培養(yǎng)。抑制關(guān)鍵miRNA的表達并抑制其靶蛋白的活性，通過細胞免疫熒光技術(shù)觀察其對DRG神經(jīng)元軸突生長的影響。
　　5.將用不同劑量的PEITC加入培養(yǎng)好的DRG神經(jīng)元之中，對DRG神經(jīng)元進行細胞免疫熒光染色并 DRG神經(jīng)元軸突的生長情況，從而選出最佳給藥劑量，并應(yīng)用RT-qPCR和Western Blot技術(shù)在miRNA水平和蛋白水平對PEITC的作用機制進行驗證。
　　6.運用

5、SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析。用均數(shù)±標準差（x±s）表示計量資料。多樣本間的比較應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA）和q檢驗。兩獨立樣本的比較采用student t檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1. miR-17-5p的表達在SDCL組大鼠DCL后的3d、7d和14d出現(xiàn)上調(diào)，其在這三個時間點的表達變化倍數(shù)分別是4.17倍、2.98倍和5.12倍；而在SNCI組，miR-17-5p在大鼠DCL后的3d

6、、7d和14d呈下調(diào)，其在這三個時間點的表達變化倍數(shù)分別是-3.31倍、-2.96倍好-3.55倍。
　　2. SNCI組的DRG組織中miR-17-5p的下調(diào)是SNCI和DCL共同作用的結(jié)果。
　　3.抑制DRG神經(jīng)元的miR-17-5p能夠增強GAP-43蛋白的表達并存進其軸突再生修復(fù)。
　　4.結(jié)合miRBase、TargetScan數(shù)據(jù)庫和文獻檢索發(fā)現(xiàn)STAT3是miR-17-5p的靶基因。
　　5.與對

7、照組相比，SNCI組大鼠DRG組織中STAT3蛋白和p-STAT3蛋白的表達水平在DCL后的4h、3d、7d、14d明顯上調(diào)；而SDCL組STAT3在DCL后的3d、7d、14d則呈現(xiàn)明顯的下調(diào)。實驗發(fā)現(xiàn) SNCI組大鼠 DRG組織中miR-17-5p的表達趨勢與STAT3蛋白和p-STAT3蛋白的表達趨勢相反。
　　6. miR-17-5p能夠通過調(diào)控 STAT3蛋白來調(diào)控 p-STAT3蛋白的水平，從而對GAP-43蛋白的表達

8、產(chǎn)生影響，最終對影響損傷的DRG神經(jīng)元軸突的修復(fù)和再生。
　　7.10μM的PEITC能夠有效下調(diào)DRG神經(jīng)元中的miR-17-5p的表達量，進而通過miR-17-5p/STAT3/GAP-43這一轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進損傷的DRG神經(jīng)元軸突的修復(fù)和再生。
　　結(jié)論：
　　1.在大鼠DCL后的3d、7d和14d，SDCL組大鼠DRG組織中的miR-17-5p的表達量出現(xiàn)上調(diào)，而SNCI組在相應(yīng)時間點下調(diào)。
　　2. SNC