通鼻止鼽方抑制過敏性鼻炎作用的實驗和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究.pdf

1、研究目的：
　　論證通鼻止鼽方抑制過敏性鼻炎的藥理作用機(jī)制，預(yù)測通鼻止鼽方的潛在藥物作用靶點和新的藥理作用。
　　研究方法：
　　實驗一：建立過敏性鼻炎小鼠模型，將實驗組分成六組（正常對照組、過敏性鼻炎模型組、鹽酸西替利嗪（陽性藥物）組、通鼻止鼽方低劑量組、通鼻止鼽方中劑量組、通鼻止鼽方高劑量組），觀察各實驗組過敏性小鼠行為學(xué)和鼻黏膜組織病理學(xué)的變化；采用ELISA法檢測各實驗組通鼻止鼽方對過敏性鼻炎小鼠血清和支氣管肺

2、泡灌洗液中免疫分子（IgE、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、ICAM-1）的變化；采用 RT-PCR實驗檢測各實驗組通鼻止鼽方對過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜組織和肺組織中炎癥相關(guān)基因（IgE、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、ICAM-1）表達(dá)的變化；采用Western Blot實驗檢測各實驗組通鼻止鼽方對過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜組織和肺組織中炎癥相關(guān)蛋白（IgE、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、ICAM-1）表達(dá)

3、的變化。
　　實驗二：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息分析的方法，構(gòu)建并分析通鼻止鼽方單味藥及整體復(fù)方的“成分-靶點-病癥”網(wǎng)絡(luò)圖。
　　研究結(jié)果：
　　結(jié)果一：各實驗組小鼠行為學(xué)變化
　　模型組與正常組相比，噴嚏數(shù)程度計分、鼻癢程度計分和鼻分泌物量計分均有顯著性差異（p<0.05）；各治療組與模型組相比，均顯著改善過敏性鼻炎小鼠打噴的行為、搔鼻行為和鼻溢行為（p<0.05）。噴嚏變化上，各復(fù)方組與陽性藥組相比，復(fù)方低劑

4、量組對噴嚏行為的改善程度顯著劣于陽性藥組（p<0.05），復(fù)方中劑量組與之比較無顯著性差異（p>0.05），復(fù)方高劑量組則顯著優(yōu)于陽性藥組（p<0.05）。鼻癢搔鼻變化上，各復(fù)方組與陽性藥組相比，復(fù)方低劑量組和中劑量組對搔鼻行為的改善程度顯著劣于陽性藥組（p<0.05），復(fù)方高劑量組與之比較無顯著性差異（p>0.05）。內(nèi)鼻分泌物量變化上，各復(fù)方組與陽性藥組相比，復(fù)方低劑量組和中劑量組對鼻溢行為的改善程度顯著劣于陽性藥組（p<0.05）

5、，復(fù)方高劑量組則顯著優(yōu)于陽性藥組（p<0.05）。
　　結(jié)果二：各實驗組小鼠組織病理變化
　　正常組小鼠鼻黏膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊，平滑而無斷裂，未見炎細(xì)胞浸潤；模型組小鼠鼻黏膜嚴(yán)重增厚，黏膜表層纖毛黏連或脫落，黏膜固有層結(jié)構(gòu)紊亂，腺管、血管嚴(yán)重擴(kuò)張、增生，重度水腫，間質(zhì)中大量嗜酸性細(xì)胞及其他炎性細(xì)胞浸潤；陽性藥組小鼠鼻黏膜少量炎細(xì)胞浸潤；復(fù)方低劑量組小鼠鼻黏膜中度增厚，固有層結(jié)構(gòu)紊亂，纖毛脫落，腺管、血

6、管輕度擴(kuò)張，輕度水腫，少量炎細(xì)胞浸潤，偶見嗜酸性細(xì)胞；中劑量組小鼠鼻黏膜輕度增厚，纖毛脫落，腺管、血管偶有擴(kuò)張，輕度水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤，偶見嗜酸性細(xì)胞；高劑量組小鼠鼻黏膜輕度充血，偶見炎細(xì)胞浸潤，未發(fā)現(xiàn)明顯增生及纖毛倒伏等改變。
　　結(jié)果三：ELISA法檢測結(jié)果
　　與正常對照組小鼠相比，過敏性鼻炎模型組小鼠血清IgE含量顯著性增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.001）；與過敏性鼻炎模型組小鼠相比，各治療組小鼠血清中的I

7、gE均有不同程度的顯著性下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.001）；與鹽酸西替利嗪陽性藥治療組小鼠相比，復(fù)方低劑量組對IgE的下調(diào)程度明顯不如陽性藥組（p<0.001），但復(fù)方中劑量組和高劑量組則與陽性藥組的效果相近，無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。與正常對照組小鼠相比，過敏性鼻炎組小鼠血清IFN-γ、IL-2顯著降低，IL-4、IL-10顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.001）；與過敏性鼻炎組小鼠相比，各治療組小鼠血清Th1和

8、Th2細(xì)胞因子含量均有不同程度的回調(diào)，其中，IFN-γ含量均有所上升，但復(fù)方低劑量組的變化沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05），其他治療組的上升程度均顯著（p<0.001）；IL-2含量的上升程度不如IFN-γ明顯，只有陽性藥組和復(fù)方高劑量組的變化有統(tǒng)計學(xué)差異（分別是p<0.001和p<0.05），其他組則沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）；IL-4含量變化顯著，各組均有明顯地下降，且均具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.001）；各組IL-10含量也均有下

9、降，但復(fù)方低劑量組（p<0.05）較其他組（p<0.001）下調(diào)作用略弱。與正常對照組小鼠相比，過敏性鼻炎模型組小鼠血清ICAM-1含量顯著性增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.001）；與過敏性鼻炎模型組小鼠相比，各治療組小鼠血清中的ICAM-1均有不同程度的顯著性下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05），但是低劑量的復(fù)方對 ICAM-1的下調(diào)程度略弱；與鹽酸西替利嗪陽性藥治療組小鼠相比，復(fù)方低劑量組對ICAM-1的下調(diào)程度略弱于陽性

10、藥組，復(fù)方中劑量則略強(qiáng)于陽性藥，但均無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05），而復(fù)方高劑量對 ICAM-1的下調(diào)作用顯著強(qiáng)于陽性藥，且具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.001）。
　　支氣管肺泡灌洗液中各細(xì)胞因子的變化程度不如血清明顯。與正常對照組小鼠相比，過敏性鼻炎組小鼠 IFN-γ、IL-2顯著降低，IL-4、IL-10顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.001）。與過敏性鼻炎組小鼠相比，各治療組小鼠支氣管肺泡灌洗液中 Th1/Th2細(xì)胞因子含

11、量均有不同程度的回調(diào)，但回調(diào)程度明顯不如血清中的細(xì)胞因子。其中，IFN-γ含量變化明顯，各治療組均有所上升，且均具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.001）；IL-2含量雖然各治療組均有上升，但只有陽性藥組的變化有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05），其他組則沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）；IL-4含量變化也只有復(fù)方高劑量組具有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）；而 IL-10含量各治療組均有下降，但均沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。
　　結(jié)果四：RT-PCR

12、法檢測結(jié)果
　　與正常對照組小鼠相比，過敏性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜組織中IgE基因表達(dá)顯著性增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.001），說明經(jīng) OVA刺激后，小鼠過敏性鼻炎的發(fā)生涉及了基因?qū)用娴拿庖咔虻鞍椎淖兓?。與過敏性鼻炎模型組小鼠相比，各治療組小鼠鼻黏膜組織中的IgE基因表達(dá)均有不同程度的下降，其中，復(fù)方中劑量組和高劑量組IgE下降程度最大，差異最明顯（p<0.001），陽性藥組次之（p<0.01），而復(fù)方低劑量組IgE表達(dá)雖然

13、也有所下降，但是與模型組比較并沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。與正常對照組小鼠相比，過敏性鼻炎組小鼠鼻黏膜中IFN-γ、IL-2基因表達(dá)顯著降低，IL-4、IL-10基因表達(dá)顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。與過敏性鼻炎組小鼠相比，各治療組小鼠鼻黏膜中Th1和Th2細(xì)胞因子的基因表達(dá)均有不同程度的回調(diào)。其中，IFN-γ的基因表達(dá)均有所上升，復(fù)方高劑量組回升最為明顯（p<0.001），陽性藥組次之（p<0.05），復(fù)方低劑量

14、組和中劑量組的變化沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）；IL-2的基因表達(dá)除復(fù)方低劑量組外，其余治療組均呈現(xiàn)回升趨勢，但只有復(fù)方高劑量組與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.01）；各組IL-4的基因表達(dá)表現(xiàn)為不同程度的回降，陽性藥組下降程度最大（p<0.001），復(fù)方中劑量組和高劑量組次之（p<0.01），復(fù)方低劑量組則與模型組相差無幾；各組 IL-10的基因表達(dá)也均有下降，但只有陽性藥組和復(fù)方高劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異（ p<0.05）。與正常對照

15、組小鼠相比，過敏性鼻炎模型組小鼠鼻黏膜中ICAM-1的基因表達(dá)顯著性增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。與過敏性鼻炎模型組小鼠相比，各治療組小鼠鼻黏膜組織中ICAM-1的基因表達(dá)均有不同程度的下降，其中，復(fù)方中劑量組的下降幅度最大，其余各組下降幅度相近，但是各組變化均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。
　　與正常對照組小鼠相比，過敏性鼻炎模型組小鼠肺組織中IgE基因表達(dá)顯著性增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.001）。與過敏性

16、鼻炎模型組小鼠相比，各治療組小鼠肺組織中的IgE基因表達(dá)均有不同程度的下降，其中，復(fù)方低劑量組和高劑量組IgE下降程度最大，差異最明顯（p<0.01），陽性藥組次之，復(fù)方中劑量組下降程度最小，且陽性藥組和復(fù)方中劑量組與模型組比較并沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。與正常對照組小鼠相比，過敏性鼻炎組小鼠肺組織中IFN-γ、IL-2基因表達(dá)顯著降低，IL-4、IL-10基因表達(dá)顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。與過敏性鼻炎組小鼠

17、相比，各治療組小鼠肺組織中 Th1和Th2細(xì)胞因子的基因表達(dá)均有不同程度的回調(diào)。其中，IFN-γ的基因表達(dá)均有所上升，但只有復(fù)方高劑量組的回升有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）；IL-2的基因表達(dá)各治療組均呈現(xiàn)回升趨勢，復(fù)方低劑量組作用最強(qiáng)（p<0.01），陽性藥組次之（p<0.05），復(fù)方中劑量組和高劑量組作用最弱（p>0.05）；各組IL-4的基因表達(dá)也表現(xiàn)為不同程度的回降，但只有陽性藥組的下降有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；各組IL-10

18、的基因表達(dá)也均有下降，但只有陽性藥組和復(fù)方中劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。與正常對照組小鼠相比，過敏性鼻炎模型組小鼠肺組織中 ICAM-1的基因表達(dá)顯著性增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。與過敏性鼻炎模型組小鼠相比，各治療組小鼠肺組織中ICAM-1的基因表達(dá)均有不同程度的下降，其中，復(fù)方中劑量組和高劑量組的下降幅度最大（p<0.01），陽性藥次之（p<0.05），復(fù)方低劑量組作用最弱且沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）。

19、>　　結(jié)果五：Western Blot檢測結(jié)果
　　與正常對照組小鼠相比，過敏性鼻炎組小鼠鼻黏膜中IgE、IL-4、IL-10表達(dá)顯著升高（p<0.01），IFN-γ、IL-2表達(dá)顯著降低（p<0.01）。與過敏性鼻炎組小鼠相比，各治療組小鼠鼻黏膜中除ICAM-1外，其他蛋白均有不同程度的回調(diào)。其中，IgE的蛋白表達(dá)均有所下降，但只有復(fù)方高劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）；IFN-γ的蛋白表達(dá)均有所上升，復(fù)方中劑量組和高劑量組回

20、升最為明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05），其他組的變化沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）；IL-2的蛋白表達(dá)只有復(fù)方高劑量組與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）；各組IL-4的蛋白表達(dá)表現(xiàn)為不同程度的回降，陽性藥組和復(fù)方高劑量組的下降程度較大，有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）；各組IL-10的蛋白表達(dá)也均有下降，復(fù)方高劑量組下調(diào)作用最強(qiáng)（p<0.001），陽性藥和復(fù)方中劑量組次之（p<0.01），復(fù)方低劑量組最弱且無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05

21、）。
　　與正常對照組小鼠相比，過敏性鼻炎組小鼠肺組織中 IgE、IL-4、IL-10、ICAM-1表達(dá)顯著升高（ p<0.01）， IFN-γ、IL-2表達(dá)顯著降低（p<0.01）。與過敏性鼻炎組小鼠相比，各治療組小鼠肺組織中的蛋白也呈現(xiàn)出不同程度的回調(diào)。其中，IgE的蛋白表達(dá)均有所下降，復(fù)方中劑量組和高劑量組作用較強(qiáng)且有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）；IFN-γ的蛋白表達(dá)除復(fù)方低劑量組外均有所上升，但只有復(fù)方高劑量組的回升有統(tǒng)計學(xué)

22、差異（p<0.05）；IL-2的蛋白表達(dá)，陽性藥組和復(fù)方中劑量組回調(diào)程度較大， 復(fù)方低劑量組和高劑量組回調(diào)程度較小，但只有復(fù)方中劑量組的變化有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）；各組IL-4的蛋白表達(dá)表現(xiàn)為不同程度的回降，陽性藥組和復(fù)方高劑量組的下降程度較大，有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05），而復(fù)方低劑量組和中劑量組的下降程度很小且無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）；各治療組對IL-10蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用較弱，均無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）；各

23、組ICAM-1的蛋白表達(dá)都有所下調(diào)，復(fù)方低劑量組和中劑量組下調(diào)程度較大（p<0.05），陽性藥組和復(fù)方高劑量組程度較?。╬>0.05）。
　　結(jié)果六：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果
　　通過現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)挖掘技術(shù)，復(fù)方各味藥含有化合物，辛夷94種，紫蘇葉118種，蔓荊子138種，苦杏仁?97種，甘草265種，蒼耳子106種，白芷219種，蟬蛻8種，川芎103種，白僵蠶21種。
　　蒼耳子網(wǎng)絡(luò)圖中含有48種化合物成分，對應(yīng)101個

24、靶點和262種病癥；白僵蠶網(wǎng)絡(luò)圖中含有14種化合物成分，對應(yīng)112個靶點和45種病癥；白芷網(wǎng)絡(luò)圖中含有62種化合物成分，對應(yīng)224個靶點和288種病癥；蟬蛻網(wǎng)絡(luò)圖中含有4種化合物成分，對應(yīng)60個靶點和99種病癥；川芎網(wǎng)絡(luò)圖中含有149種化合物成分，對應(yīng)216個靶點和283種病癥；甘草網(wǎng)絡(luò)圖中含有118種化合物成分，對應(yīng)301個靶點和335種病癥；苦杏仁網(wǎng)絡(luò)圖中含有47種化合物成分，對應(yīng)272個靶點和332種病癥；蔓荊子網(wǎng)絡(luò)圖中含有99種

25、化合物成分，對應(yīng)269個靶點和322種病癥；辛夷網(wǎng)絡(luò)圖中含有67種化合物成分，對應(yīng)156個靶點和265種病癥；紫蘇葉網(wǎng)絡(luò)圖中含有87種化合物成分，對應(yīng)288個靶點和310種病癥。通鼻止鼽方復(fù)方網(wǎng)絡(luò)圖中含有508種化合物成分，對應(yīng)672個靶點和470種病癥，病癥中包括過敏性鼻炎、變應(yīng)性疾病、呼吸道變應(yīng)性炎癥等。
　　預(yù)測得到IL-2、IFN-γ、IL-4、IRF-1、IL-6、IL-36B、ITGA2B、IL-1A、IL-1B、IC

26、AM-1、ITGB2、IL-13、MMP-1、JUN、ALOX5、RELA、IL-10、ITGAM等18個復(fù)方作用于過敏性鼻炎的潛在靶點蛋白。
　　研究結(jié)論：
　　通過上述研究發(fā)現(xiàn)通鼻止鼽方能有效抑制過敏性鼻炎病變，通鼻止鼽方多成分多靶點的特點同時又能對多種疾病有著調(diào)節(jié)作用，其主要途徑和機(jī)制：
　?、僦饕ㄟ^調(diào)節(jié) IgE、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、ICAM-1等因子的表達(dá)；
　?、谕ū侵棍娇赡?/p>