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1、嵌合體是由不同遺傳組成的細(xì)胞或者組織構(gòu)成的嵌合生物個(gè)體。通過電融合制作小鼠四倍體胚胎與二倍體胚胎或者ES細(xì)胞嵌合后,四倍體胚胎來源的細(xì)胞貢獻(xiàn)到胚外譜系中,二倍體細(xì)胞可以貢獻(xiàn)到胚內(nèi)和胚外譜系中,胚胎發(fā)育到期后能夠得到完全來自二倍體胚胎或者ES的個(gè)體,這種方法稱為四倍體補(bǔ)償技術(shù)。因此,四倍體補(bǔ)償技術(shù)可以繞過傳統(tǒng)二倍體嵌合小鼠階段,直接得到基因修飾的小鼠。除此之外,嵌合體的研究有助于胚胎細(xì)胞發(fā)育分化的研究和特殊物種基因保存,在動(dòng)物育種、生產(chǎn)轉(zhuǎn)
2、基因動(dòng)物研究、醫(yī)學(xué)、產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用等眾多領(lǐng)域也都具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。
但關(guān)于豬嵌合體的研究鮮有報(bào)道,如何優(yōu)化豬四倍體胚胎的制作方法,二倍體胚胎與四倍體胚胎嵌合最佳時(shí)期的確定,以及嵌合后不同倍性來源的細(xì)胞在嵌合囊胚中時(shí)如何分布等,都沒有相關(guān)的報(bào)道,有待于研究。因此,為了探索豬的四倍體制作方法,四倍體嵌合體的制作方法,探索四倍體嵌合的生物學(xué)現(xiàn)象的觀察,為建立與豬相關(guān)的疾病模型和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作方法等奠定基礎(chǔ),本研究進(jìn)行豬四倍體和四倍體
3、嵌合的相關(guān)研究。
1制作豬四倍體胚胎體系的優(yōu)化制作豬四倍體胚胎的最佳條件是90V,其融合率(82.33±6.13)、囊胚率(28.38±2.41)、胚胎死亡率(13.24±4.43)。
2.豬四倍體胚胎的發(fā)育時(shí)程和囊胚質(zhì)量檢測(cè)觀察胚胎發(fā)育時(shí)程,發(fā)現(xiàn)四倍體在發(fā)育早期稍晚于二倍體胚胎,但是發(fā)生致密化和囊胚形成時(shí)間相近,并且四倍體與二倍體的發(fā)育率接近無顯著差異,但4N囊胚細(xì)胞數(shù)(21.90±4.95)與2N囊胚細(xì)胞
4、數(shù)(45.34±5.00)差異顯著。
3.熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測(cè)四倍體的倍性用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)了胚胎的倍性,檢測(cè)融合后胚胎發(fā)育到囊胚時(shí)融合后發(fā)育的囊胚中68.18%為四倍體,27.27%為二倍體,4.5%為2N/4N嵌合胚胎。對(duì)照組二倍體囊胚中95%為二倍體,5%為2N/4N嵌合胚胎。
4.2N-4N胚胎嵌合最佳聚合時(shí)期的探索4-Cell(4 N)<->4-Cell(2 N)聚合方式的囊胚率(7
5、4.36%)、囊胚細(xì)胞數(shù)(67.10±15.39)顯著高于其它試驗(yàn)組。
5.2N-4N嵌合胚胎中不同倍性細(xì)胞分布特征4-Cell(4 N)<->4-Cell(2 N)聚合20對(duì),獲得12個(gè)囊胚,其中10個(gè)囊胚中2N胚胎細(xì)胞主要分布于ICM位置,少量分布于TE位置;另外2個(gè)囊胚中沒有出現(xiàn)任何的GFP信號(hào),應(yīng)該是沒有嵌合成功。反試驗(yàn)組中,聚合10對(duì),發(fā)育得到5個(gè)囊胚,發(fā)現(xiàn)ICM外層和大部分的TE部位為4N胚胎來源細(xì)胞。
6、 6.四倍體胚胎與IPS細(xì)胞嵌合的研究夾心聚合法進(jìn)行嵌合時(shí),IPS細(xì)胞團(tuán)與4N胚胎進(jìn)行嵌合成功,囊胚率為62.5%,囊胚中IPS嵌合率為45%。顯微注射法制作嵌合胚胎,注射的IPS細(xì)胞成功嵌合到2N和4N囊胚中,2N囊胚中IPS嵌合率為21.54%,4N囊胚中IPS嵌合率為29.79%。
綜上所述,本研究獲得了豬四倍體制作優(yōu)化體系,探索了四倍體與二倍體胚胎的嵌合和四倍體胚胎與IPS細(xì)胞的嵌合情況,為豬的四倍體胚胎和四
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