中性粒細胞與再生障礙性貧血免疫抑制治療療效關系的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 粒細胞集落刺激因子治療的中性粒細胞反應預測重型再生障礙性貧血免疫抑制治療早期療效的研究
　　目的：探討重型/極重型再生障礙性貧血(SAA/VSAA)患者免疫抑制治療(IST)前應用粒細胞集落刺激因子(G-CSF)治療的中性粒細胞反應(ANC反應)，對于IST早期療效的預測價值。
　　方法：回顧性分析我中心呢2005年9月至2011年11月間接受一線IST治療，并于IST前

2、接受G-CSF治療的共125例SAA/VSAA患者臨床資料。G-CSF治療第n天內最大△ANC≥0.5×109/L定義為G-CSF治療有ANC反應，＜0.5×109/L定義為無反應。首先分別總結IST前應用G-CSF治療有ANC反應組和無ANC反應組的IST近期療效，并對二者進行相關性分析。進而為細化、優(yōu)化這一預測指標，分別分析G-CSF治療第5天、7天、10天、13天、14天、16天和21天有無ANC反應與IST早期療效的關系，尋找預

3、測IST早期療效的最佳ANC反應時間。進而，繪制G-CSF治療后10天內ANC增高程度（△ANC）預測IST療效的ROC曲線，探索G-CSF治療的ANC反應預測IST早期療效的最佳△ANC界限值。
　　結果：IST前接受G-CSF治療，獲得ANC反應組IST后3個月血液學反應（IIR）為49％，6個月HR為61.2％，均顯著高于無ANC反應組（3個月HR28.9％，P=0.023;6個月HR40.8％，P=0.026）。G-CSF

4、治療5天，7天內ANC反應尚不能提示IST后3個月及6個月HR，而以G-CSF治療10d內△ANC≥0.5×109/L作為ANC反應界值預測IST后3個月及6個月療效最佳，ROC曲線下面積最大，且與更長時間應用G-CSF治療ANC反應來預測IST后HR的效能接近。G-CSF治療10d內獲得ANC反應為IST后3個月療效的獨立預后因素(P=0.004)，但并非IST后6個月療效的獨立預后因素。G-CSF治療ANC反應組患者5年總生存率顯著

5、高于無反應組[（92.8±4.0）％對（69.5±6.5）％，P=0.025]。
　　結論：IST前G-CSF治療的ANC反應可提示骨髓殘存造血，是方便、實用的預測IST早期療效及長期生存的指標。
　　第二部分 不同中性粒細胞閾值的極重型再生障礙性貧血患者接受免疫抑制治療的血液學反應及生存研究
　　目的：分析不同中性粒細胞計數(ANC)閾值的極重型再生障礙性貧血(VSAA)患者接受一線免疫抑制治療(IST)的早期血液學

6、反應(HR)和長期生存情況。
　　方法：回顧性分析我中心2006年1月至2011年10月期間連續(xù)收治的145例接受一線r-ATG聯合環(huán)孢素IST的VSAA患者臨床資料。評估不同ANC閾值下VSAA患者的早期死亡、早期HR、長期生存情況，并以受試者操作特征曲線（ROC曲線）法優(yōu)化ANC預測VSAA患者HR的臨界值。并進行VSAA患者HR及生存相關因素分析。
　　結果：VSAA患者IST后3個月HR率為35.9％，6個月HR率為

7、46.9％，5年OS率為75.0±3.7％，均明顯劣于SAA(IST后3個月HR率為65.5％，P=0.000;6個月HR率為74.5％，P=0.000;5年OS率為92.5±2.6％, P=0.000)。且VSAA早期死亡率高達8.3％(SAA患者僅為2.7％，P=0.062)。設定VSAAIST前ANC閾值分別≤0.15×109/L、≤0.10×109/L和≤0.05×109/L，相應群組患者早期死亡率分別為9.2％(12/130)

8、、9.9％(11/111)和13.4％(11/82)，即12例早期死亡的VSAA中有11例(91.7％) IST前ANC≤0.05×109/L; IST后3個月HR率分別為33.8％(44/130)、27.9％(31/111)和22.0％(18/82);6個月HR率分別為43.8％(57/130)、39.6％(44/111)和34.1％(28/82);5年OS率分別為73.1±4.0％、70.3±4.4％和62.5±5.4％;5年EFS

9、率分別為48.3±4.5％、45.1±4.8％和42.3±5.5％。以0.05×109/L為ANC界值預測VSAA患者IST后6個月HR和12個月CR+GPR最佳，預測IST后6個月HR靈敏度為58.8％、特異度為70.1％;預測12個月良好HR靈敏度60.9％、特異度72.4％。ANC≤0.05×109/L的VSAA患者早期死亡率為11/82(13.4％)，占VSAA早期死亡患者的91.7％(11/12); IST后3個月HR率為18

10、/82(22.0％);6個月HR率為28/82(34.1％);5年OS率為（62.5±5.4）％;5年EFS率為（42.3±5.5）％。
　　結論：ANC≤0.05×109/L的VSAA患者接受一線IST早期死亡率高、療效差。
　　第三部分：CRISPR/Cas9介導的ASXL1基因突變干擾U937人髓系白血病細胞分化及其機制研究
　　目的：ASXL1基因突變常見于各髓系腫瘤和骨髓衰竭性疾病的惡性轉化，且為發(fā)生白血病轉

11、化和不良預后的相關因素。本研究旨在探討ASXL1基因突變對人白血病細胞功能的影響及其作用的分子生物學機制，為ASXL1基因突變在髓系腫瘤性疾病中的作用提供更多依據，為個體化和靶向治療提供更多的線索。
　　方法：應用CRISPR/Cas9基因編輯系統構建ASXL1敲除的U937人白血病細胞系。應用流式細胞術進行GFP陽性單個細胞分選并擴增為單個細胞來源的克隆。Sanger測序檢測各細胞系ASX L1基因突變情況，篩選出含ASXL1雜

12、合及純和突變的克隆細胞系。應用瑞士吉姆薩染色分析細胞形態(tài)，G帶進行細胞染色體核型分析，應用5-氟尿嘧啶誘導細胞凋亡，研究其對各細胞系增殖抑制和凋亡誘導情況，應用PMA誘導細胞分化并比較ASXL1突變細胞系與野生型分化情況異同，應用流式細胞術測定細胞周期、細胞凋亡和細胞分化等。進行RNA測序篩選在ASXL1突變克隆中差異性表達的基因，并進而進行信號通路分析、基因集分析等，研究ASXL1突變對下游基因表達的影響，應用逆轉錄定量PCR和蛋白印

13、跡法驗證差異性表達基因。
　　結果：應用CRISPR/Cas9基因編輯技術結合單個細胞分選技術構建單個細胞來源的人U937細胞系，共獲得56個野生型細胞系（ASXL1基因野生型的U937單個細胞來源細胞系），另外17個突變型細胞系（6個含ASXL1雜合突變和11個含ASXL1純和突變），突變細胞系均含有共同的c.594insA(Ser199G1ufsx55)位點突變，此突變基因能夠編輯提前終止編碼的截短蛋白。其中3個ASXL1雜合

14、突變克?。∕T1，MT2和MT3），3個ASXL1純和突變克隆(MT11，MT12和MT13)，2個轉染后的ASXL1野生型克?。╓T1和WT2），以及未經轉染的親代細胞系WTblk用于進一步細胞功能及RNA測序等實驗。整體來看，各個單細胞克隆之間異質性較大，但野生組與ASXL1雜合突變組、ASXL1純和突變組，在細胞增殖，凋亡，細胞周期分布，5-氟尿嘧啶誘導的細胞增殖抑制和誘導細胞凋亡方面并無顯著差異。而ASXL1雜合突變組和ASXL

15、1純和突變組相對于野生組均表現出對于PMA誘導的單核細胞向吞噬細胞分化能力顯著降低，表現為PMA誘導分化后96小時，CD11陽性細胞比例及CD11中位熒光指數均顯著低于野生組。RNA測序及信號通路和基因集分析顯示，ASXL1雜合及純和突變克隆，髓系分化相關基因通路整體表達下降，其中與髓系分化相關的基因CYBB和CLEC5A表達水平顯著降低。同時，與細胞存活相關的基因集包括干擾素a反應通路、MYC靶基因通路和STAT3靶基因通路等廣泛下調

16、。此外，染色體核型分析顯示相對于未經轉染的親代細胞系WTblk，轉染后的ASXL1野生型克隆并未出現額外的染色體核型異常，而ASXL1突變克隆不同程度得獲得額外染色體異常，在4個檢測的ASXL1突變克隆中有3個獲得11號染色體長臂缺失。
　　結論：ASXL1基因突變通過下調與髓系分化密切相關的CYBB和CLEC5A等基因干擾髓系分化。此外，ASXL1突變廣泛干擾與細胞生存相關的基因通路，并增加人白血病細胞的遺傳不穩(wěn)定性。我們應用C