基于卟啉的仿酶組裝及其生物識別分析應用.pdf

1、高靈敏度、廣通用性的生化分析方法對于生物醫(yī)學、環(huán)境科學、食品學等學科的發(fā)展至關重要。通常相應的特異性分析方法主要利用生物酶作為分子標記進行信號轉換，將生物分子識別反應信號轉換為其他更容易檢測的物理化學信號。然而，生物酶在穩(wěn)定性、實用性等方面并不能滿足臨床和超靈敏分析的要求，因此尋找新的信號轉導標記分子是當前研究的重點。其中，借鑒天然酶等的結構，利用生物或納米材料等仿生組裝合成可替代的模擬酶的信號標記是其中最有效的途徑。
　　卟啉是

2、過氧化物酶、血紅素、細胞色素和葉綠素等生物大分子的核心部分，基于卟啉分子的仿生組裝體系在生物傳感領域的應用已經有了極其豐富的工作。就其研究方向來說，主要是通過卟啉分子的自身的催化性能，與其他生物或納米材料通過簡單吸附結合克服卟啉單體自身的聚集效應，其組裝后的仿生體在結構上與天然酶的結構相差較遠，且組裝過程和催化機理的研究并不清楚;另一方面，基于卟啉分子的光電性能的仿生組裝研究的更是較少涉及。因此，探討卟啉的催化機理，選擇更好仿生組裝材料

3、來模擬天然酶結構，合成信號轉換效率高和穩(wěn)定性好仿生組裝體十分重要。
　　本論文以卟啉的仿生組裝為核心，嘗試利用多種材料實現對過氧化物酶結構和催化功能的仿生模擬，改善卟啉單體的催化性能和信號轉導能力，結合生物分子識別反應構建特異性的生化檢測方法，開展生物化學分析，將包括五部分工作:
　　1、基于過氧化物酶的SPR-DNA傳感器的研發(fā)
　　辣根過氧化物酶是以鐵卟啉為輔基的亞鐵血紅素的蛋白質，催化過氧化物反應，廣泛用于各類生

4、化檢測項目。因此，本工作發(fā)展了基于天然辣根過氧化物酶催化聚合反應的表面等離子共振(Surface plasmon resonance，簡稱SPR)基DNA傳感檢測方法，利用非共價功能化的石墨烯納米片作為傳感基底，并以酶催化誘導的聚合反應作為質量增強劑。該傳感器設計方案有多方面目標:首先，通過電化學沉積的方法原位氧還原石墨烯薄膜，并以此優(yōu)化SPR金膜的基底，由原子力顯微拓撲圖技術表征該過程，最終使總體的SPR信號響應更加靈敏。其次，以鎳離

5、子螯合的胺基三乙酸作為分子支架，苝基衍生物以π-π共軛吸附在石墨烯支撐的SPR金片表面，以鎳離子的存在使其支架分子保持一定的組裝方向，隨后在生物素鰲合在介質表面，捕獲探針與生物素相連后可以實現自組裝，且維持特定的方向。最后，借鑒夾心免疫分析策略，在目標DNA結合在探針表面后，辣根過氧化物酶標記的報告DNA，實現酶標記單元的結合，實時地將苯胺作為質量增強信號單位劑轉化為大分子聚苯胺沉淀，協(xié)同實現信號的放大。運用上述配置，得到對特異性DNA

6、精確檢測且可重現檢測的平臺，檢測下限達到飛摩爾水平，該部分工作實現了以天然酶為信號標記的沉積反應放大SPR-DNA檢測靈敏度。
　　2、基于卟啉與dsDNA仿生組裝催化的SPR-DNA傳感器
　　該部分設計一種基于“仿生組裝的催化沉積”的免標記、超靈敏表面等離子體共振(SPR)核酸分析策略。首先在SPR金片表面以自組裝的方式結合肽核酸作為捕獲探針，使其可進一步與目標DNA雜交。當捕獲探針與目標DNA雜交后，目標DNA末端暴露

7、出的部分核酸序列可以打開頸環(huán)結構DNA(H1，H2)引發(fā)雜交鏈聚合反應(HCR)，形成具有一定長度的納米級DNA雙鏈。基于文獻可知卟啉分子可以通過“溝槽嵌入”技術結合到DNA雙鏈雙螺旋結構的大溝槽內。帶正電荷的對稱結構卟啉FeⅢmeso-tetra(N-methyl-4-pyridyl)porphine(FeTMPyP)可適時、動態(tài)地與雙鏈DNA結合組裝成卟啉-dsDNA結構。由于FeTMPyP作為一種高效的催化劑，DNA雙螺旋大溝槽結

8、構可以作為附載體結合大量FeTMPyP形成具有高催化活性，快速催化動力學性質和更高的穩(wěn)定性的仿生催化劑。該仿生催化劑以4-氯-1-萘酚作為電子供體，催化其還原雙氧水，并將4-氯-1-萘酚氧化為不溶性的沉淀物沉積在SPR金片界面，達到典型的SPR信號放大效應。該部分工作實現了對天然酶催化功能的模擬，到達了提高檢測靈敏度的效果。
　　3、基于同步生成銅膠束的催化沉淀的SPR-DNA傳感器
　　該部分以DNA為模板原位合成銅納米膠

9、束，并可以吸附催化基于納米材料的比表面積來實現信號放大。首先，通過優(yōu)化探針序列選擇合適探針序列，同時目標DNA作為橋梁分子可組裝在探針DNA層，并開啟TdT酶延長DNA鏈反應，該過程可有SPR實現動態(tài)監(jiān)控并作為第一步放大反應。接著，由于合成的DNA模板鏈存在，納米銅膠束可以在DNA骨架上合成，通過銅離子吸附在DNA骨架表面，而后抗壞血酸鈉還原形成銅膠束。該過程有電子投射顯微鏡(TEM)和電化學等技術進行表征，并可以在SPR信號上檢測到第

10、二步放大反應。最后，由于存在銅膠束的納米比表面積，故兒茶酚紫可吸附在其表面并在雙氧水催化下形成寡聚物，沉積在SPR金片表面。最后導致電化學信號的增加和SPR信號的第三步放大。通過以上三重放大反應實現對3.21飛摩爾濃度檢測，該部分工作展現了多種放大技術和納米材料在SPR放大方面的應用潛力。
　　4、基于卟啉與類石墨烯納米片仿生組裝的ECL病毒基因檢測
　　該部分合成一種有高催化性能和良好延展性的二維石墨烯片實現卟啉分子的仿生

11、組裝，以達到和天然酶類似的催化效果，繼而設計檢測流感病毒基因的電致化學發(fā)光傳感器。其基本思想是從結構和分子生物學層面，對天然酶結構進行解構與仿生重建。提取過氧化物酶的酶促反應活性中心-卟啉，以廉價均質、具有類石墨烯結構的二維納米氮化碳單層材料作為載體逼近并還原該輔基的化學環(huán)境，耦合簡易的取代基修飾、π-π共軛和軸向配位的組裝方式，實現在結構上對天然酶的模擬;并進一步以酶促反應涉及的若干動力學參數，如米氏常數（KM）等作為主要技術指標，通

12、過聯(lián)用多種先進的表征分析手段比較并驗證模擬酶在活性上與天然酶相當。以H7N9病毒亞基相互作用的核酸序列作為捕獲探針，將該探針組裝在量子點電極表面，當有H7N9病毒亞基存在時，捕獲探針松散的“頸環(huán)”結構打開，剛性的雙鏈結構使其末端生物素暴露，通過生物素與親和素的反應，將親和素修飾的模擬酶標記組裝到電極表面，消耗共反應劑過氧化氫以衰減量子點的發(fā)光實現對DNA的靈敏檢測。該部分工作實現了對天然酶結構和功能的雙重模擬，提高了模擬酶的穩(wěn)定性，可作

13、為天然酶的替代物。
　　5、基于卟啉與生物蛋白仿生組裝的免疫識別反應ECL傳感器
　　受綠色熒光蛋白結構性能的啟發(fā)，這部分用Zinc proto-porphyrin IX(ZnPPIX)取代天然血紅蛋白空穴中的輔基，合成可自身發(fā)光的重構ECL生物大分子蛋白，進而用于早期癌癥的檢測。該重構蛋白在均相體系中合成、發(fā)光波長藍移至遠紅光區(qū)的638 nm、可通過電激發(fā)紅光ECL信號并簡稱為重構ECL蛋白（RErP）。重構所用輔基和RE

14、rP結構可分別用紫外和圓二色光譜(CD)進行表征。同時，其結構特征中關鍵的結合常數和結合力等性能參數可用表面等離子體共振(SPR)進行研究。其親和素修飾過程可用質譜和紫外光譜等技術進行驗證。熒光技術重點研究了該重構蛋白的光學性能和ECL性能，最終證明其是一個可通用的和高光學性能的發(fā)光體。另一方面，單線態(tài)的卟啉可進行多維標記和自我多重光學放大，可擺脫對納米材料的依賴。同時其光學耐受性的轉導技術直接來自于RErP蛋白自身對單線態(tài)氧分子的催化