基于酶擴增的新型銀納米簇合成方法的構建及其生物傳感應用.pdf

1、近幾年，以DNA為模板合成的銀納米簇(DNA-AgNCs)在生物傳感及成像領域吸引了越來越多科學家的關注。由于量子產率高、抗光漂白性強及細胞毒性低等優(yōu)點，DNA-AgNCs已經被廣泛應用于生物傳感器的設計中，在生物標記及生物成像中也有較多的應用。末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)是一種特殊的DNA聚合酶。由于其不需要模板的性質，TdT在核酸標記上已有較多的應用。本文基于末端脫氧核苷酸轉移酶的擴增，開發(fā)出一種新型的DNA-AgNCs合成方法，

2、并將其應用于核酸酶的活性檢測及蛋白質的分析中。具體如下:
　　1.利用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)催化擴增單鏈DNA的性質，構建了一種新型合成DNA-AgNCs的方法。通過TdT在一條不能夠用作DNA-AgNCs合成模板的DNA的3'-OH端擴增出一段富含胞嘧啶(C)的DNA序列，然后利用該擴增的富C序列成功地合成出了具有熒光性質的DNA-AgNCs。另外，我們考察了會影響TdT擴增及DNA-AgNCs合成的幾個因素。我們還把以

3、TdT的擴增產物DNA-P-Cn作為模板合成的DNA-AgNCs與幾條人工合成的短鏈富C序列作對比，發(fā)現(xiàn)以DNA-P-Cn為模板的DNA-AgNCs的熒光強度要高很多。接著，利用透射電子顯微鏡(TEM)及其附件X射線能譜分析儀(EDS)來對DNA-AgNCs進行表征。結合TEM的結果，我們推斷長鏈模板合成的DNA-AgNCs熒光更強的原因是因為:
　　1）.長鏈序列移除AgNCs表面的極性溶劑，更好地保護AgNCs;
　　2

4、）.AgNC之間存在熒光共振能量轉移(FRET)現(xiàn)象。
　　2.基于新型DNA-AgNCs合成方法，我們開發(fā)出了一種末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)的活性分析方法。該方法獲得的檢測限(0.0318U)比早前關于TdT活性檢測的報道中的低200倍左右，實現(xiàn)了無標記、高靈敏地對TdT酶活進行“turn-on”檢測。同時，該方法具有比較穩(wěn)定的重現(xiàn)性，在實際樣品中的添加回收實驗也取得令人滿意的結果。最后，我們分析了TdT的幾種常見抑制劑（焦

5、磷酸鈉、金精三羧酸和三磷酸腺苷）的抑制效果。
　　3.基于TdT對隨機底物的擴增及DNA-AgNCs的合成，我們開發(fā)出一種具有普適性的核酸酶“turn-on”檢測方法。我們選取限制性內切酶及3'-5'核酸外切酶的典型代表——EcoRⅠ和ExoⅢ作為目標分析物。實驗得出，EcoRⅠ的檢測限為0.0629U，ExoⅢ的檢測限為0.00867U，均比相關文獻中報道的要低。此外，對兩種酶檢測的信背比(S/B)分別為30.3及103.2。因

6、此該方法具有很高的靈敏度。由于核酸酶對底物的特異性而具有很好的選擇性。此外，該方法只需要對DNA底物稍作改動，就可以應用于切刻酶、DNA連接酶、甲基化酶及堿性磷酸酶等DNA相關酶類的活性分析中。
　　4.基于凝血酶的核酸適體及切刻酶Nb.BbvCI，我們把新型DNA-AgNCs合成方法應用于凝血酶的“turn-on”放大檢測。通過合理地設計實驗中涉及的兩條DNA探針——一條核酸適體探針及一條擴增探針，我們實現(xiàn)了高靈敏度地檢測痕量凝