PTD-Foxp3免疫功能的研究.pdf

1、自然調(diào)節(jié)性T細胞（naturalregulatoryTcells，nTregs）調(diào)節(jié)生理及病理情況下機體的免疫應(yīng)答，對于維持機體自身免疫耐受及免疫自穩(wěn)具有重要作用。Foxp3在nTregs中高表達，是nTregs發(fā)生、發(fā)育及功能發(fā)揮必不可少的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。同時Foxp3與其他T細胞如Th1、Th17等的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子相互作用，與它們的分化發(fā)育存在密切的相關(guān)性，參與了臨床各種免疫疾病的病理過程。
　　 HIV-Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(

2、proteintransductiondomains，PTD)能將外源性的生物分子帶入細胞內(nèi)，甚至核內(nèi)，但對細胞無毒副作用，已廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究中，是生物醫(yī)藥重要的給藥載體，為生命科學研究領(lǐng)域提供了新的工具。
　　 目的:研究PTD-Foxp3融合蛋白的生物學功能，觀察其對Tregs、Th17、Th1等亞群分化的調(diào)節(jié)作用及對免疫相關(guān)性疾病的治療作用，為最終應(yīng)用于臨床器官移植及自身免疫病等免疫相關(guān)性疾病的治療提供理論和實驗室依據(jù)

3、。
　　 方法:
　　 (1)人淋巴瘤細胞系Jurkat或從外周血分離人PBMCs和CD4+CD25-T細胞，經(jīng)融合蛋白PTD-人FOXP3(PTD-hFOXP3)處理后，分別采用CCK-8法檢測CD4+CD25T細胞活化增殖能力及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+CD25-T細胞對效應(yīng)細胞的增殖抑制能力:RT-PCR檢測IL-2、INF-γ、IL-10、IL-4、TGF-β和CTLA-4的mRNA表達水平;ELISA測定上清中IL-2

4、、INF-γ、IL-10和TGF-β的分泌水平及流式細胞術(shù)檢測CD25和CTLA-4蛋白水平的表達;同時用CCK-8法檢測PTD-hFOXP3對雙向混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)的抑制作用;最后采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗檢測FOXP3在IL-2啟動子區(qū)的富集情況;
　　 (2)體外觀察融合蛋白PTD-小鼠Foxp3(PTD-mFoxp3)對小鼠Th1和Th17分化的調(diào)節(jié)。分離CD4+T細胞，經(jīng)細胞因子誘導(dǎo)Th1、Th17，

5、加入PTD-mFoxp3處理，再采用定量PCR和流式細胞術(shù)分別檢測INF-γ、T-bet、IL-17A、RORγtmRNA表達水平和INF-γ、IL-17A的蛋白表達水平變化來評價PTD-mFoxp3對這兩種T細胞亞群分化的影響;
　　 (3)采用PTD-mFoxp3治療OVA誘導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)(Delayedhypersensitivityreaction，DTH)模型小鼠局部，通過觀察耳廓腫脹程度，組織切片的組織病理變化，

6、脾細胞對OVA的應(yīng)答能力，耳廓局部組織及引流淋巴結(jié)分泌INF-γ能力等指標來觀察PTD-mFoxp3對Th1介導(dǎo)的DTH的治療作用.
　　 結(jié)果:
　　 (1)PTD-hFOXP3能明顯抑制CD4+CD25-T細胞的活化增殖，且其轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+CD25-T細胞能抑制CD3/CD28抗體活化的CD4+CD25-效應(yīng)T細胞增殖;RT-PCR、ELISA及FCM結(jié)果表明PTD-hFOXP3明顯下調(diào)IL-2與IFN-γ的表達，而

7、上調(diào)IL-4、IL-10、TGF-γ和CTLA-4的表達;PTD-hFOXP3還能抑制雙向MLR;ChIP結(jié)果顯示FOXP3富集于IL-2啟動子區(qū);
　　 (2)體外在重組細胞因子及CD3/CD28抗體誘導(dǎo)條件下，CD4+T細胞可以向Th1、Th17方向分化;在Th1極化條件下，經(jīng)PTD-mFoxp3處理后，IFN-γ與T-betmRNA表達水平明顯下降，流式細胞術(shù)結(jié)果顯不IFN-γ+CD4+T細胞比率也明顯降低;在Th17極化

8、條件下，PTD-mFoxp3能下調(diào)IL-17A與RORyt的mRNA表達水平及IL-17A的蛋白表達水平;
　　 (3)耳局部給予PTD-mFoxp3治療DTH模型小鼠，可以明顯減輕耳廓的腫脹程度，改善耳廓局部組織炎癥情況;耳局部引流淋巴結(jié)細胞分泌IFN-γ水平降低，而Foxp3表達水平上調(diào)。
　　 結(jié)論:PTD-hFOXP3可以將CD4+CD25-T細胞轉(zhuǎn)化為Treg樣細胞;PTD-mFoxp3抑制了CD4+T細胞體外