RNA干擾中siRNA不同類型的修飾對干擾活性的影響以及關(guān)鍵蛋白RHA的機制研究.pdf

1、RNA干擾（RNAi）是由長度為20-30nt的小雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象，該生命過程在進化上高度保守，調(diào)控者眾多編碼功能蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。經(jīng)典的siRNA介導(dǎo)的RNA干擾途徑通過與靶標mRNA互補配對實現(xiàn)對同源序列表達水平的下調(diào)：長雙鏈RNA（dsRNA）Dicer酶切割成21nt大小末端帶有2nt懸突的siRNA，雙鏈siRNA上載到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing compl

2、ex， RISC）上，引導(dǎo)鏈（guide strand）引導(dǎo)RISC復(fù)合物以同源互補配對的方式尋找靶mRNA，并行使切割活性。RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complexes，RISC），是由siRNA中的引導(dǎo)鏈（guide strand）以及相關(guān)蛋白質(zhì)組分所構(gòu)成的復(fù)合物，在RNA干擾途徑中行使活性功能的效應(yīng)器。其核心組分包括：Dicer等 RNase III家族蛋白、siRNA或 miRNA、行使

3、 mRNA切割活性的 Argonaute家族蛋白，以及其他dsRNA結(jié)合蛋白（TRBP）和RNA Helicase等。由于RNA干擾技術(shù)能夠特異性地剔除或關(guān)閉特定基因的表達，所以該技術(shù)在探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。目前利用納米顆粒的載藥體系是研究熱點之一。目前所報道的納米顆粒，如陽離子多聚體，金納米顆粒等有些許的不足之處。我們提出了新的納米顆粒的構(gòu)建策略，希望通過最少的化學(xué)修飾讓siRNA通過堿基互補配

4、對的作用形成納米顆粒。
　　本文通過對一系列不同結(jié)構(gòu)特征的siRNA納米顆粒干擾活性的測定，探究活性與結(jié)構(gòu)之間的構(gòu)效關(guān)系。具體方法是：通過巰基和馬來酰亞胺的邁克爾加成反應(yīng)，將帶有 Dicer酶切割位點的 siRNA通過末端巰基修飾連接到有三個可反應(yīng)位點的小分子上，然后通過堿基互補配對的作用，控制條件，形成一定構(gòu)型的納米顆粒。然后測定細胞水平的RNA干擾活性，評價不同修飾的活性關(guān)系。該方法得到的siRNA納米顆粒具有較好的RNA干擾

5、活性，同時也有較好的血清穩(wěn)定性，有利于進一步用于活體水平研究，同時為設(shè)計更高效的 siRNA分子提供理論依據(jù)。除了siRNA納米顆粒外，siRNA的修飾手段還有很多種。其中實驗室的前人設(shè)計出一種高活性的小發(fā)夾RNA（short hairpin RNA, shRNA）結(jié)構(gòu)，IC50數(shù)值在pM級別，屬于超高活性結(jié)構(gòu)。為了得到序列的普適性結(jié)果，我們驗證了該結(jié)構(gòu)在其他序列上的效果。選取了三個人的內(nèi)源基因，通過siQuant體系構(gòu)建帶有靶標的螢火

6、蟲熒光素酶質(zhì)粒，利用 T7轉(zhuǎn)錄方式得到 shRNA，驗證在人體HEK293A細胞水平的 RNA干擾活性。結(jié)果表明，shRNA相比21nt未修飾的siRNA活性有所提高，但是卻未達到pM級別。除了針對小分子siRNA的研究之外，對RNA干擾途徑中的關(guān)鍵蛋白的功能和調(diào)控小分子化合物也進行了探究。人體ATP依賴的RNA解旋酶 A（RNA Helicase A，RHA）被證實參與了 RNA干擾途徑，并且作為 RISC loading compl

7、exes的組成部分，與Dicer、Ago2、TRBP相互作用，影響著 siRNA的引導(dǎo)鏈上載到RISC復(fù)合物的這一過程。。RHA作為ATP依賴的RNA解旋酶家族蛋白，可以特異性地以3’-5’的方向解開RNA雙鏈或RNA-DNA雜合鏈。實驗室之前的工作證實氟化喹諾酮類化合物（如：依諾沙星）能夠增強RNA干擾效應(yīng)，可以減弱由于使用高濃度siRNA所造成的脫靶效應(yīng)：在達到相同干擾活性的目標下，使用喹諾酮類化合物可相應(yīng)地減少2-5倍 siRNA

8、的用量。將RHA在RNA干擾途徑中的功能和喹諾酮類化合物的增強效應(yīng)結(jié)合起來，我們可以推測：RHA可能作為喹諾酮類化合物增強RNA干擾的靶標蛋白。喹諾酮類化合物通過抑制RHA的雙鏈RNA解旋酶活性，使上載到RISC復(fù)合物中的活性雙鏈RNA的濃度升高，而表現(xiàn)出增強的RNA干擾效果。我們利用HEK293細胞體系，驗證得到了RHA蛋白全酶的過表達對于RNA干擾的增強作用，及其與小分子依諾沙星對RNA干擾的協(xié)同增強效應(yīng)。下一步把RHA全酶劃分為三