大豆幼苗期耐鹽QTL的定位及候選基因的克隆.pdf

1、土壤鹽漬化和次生鹽漬化是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的一個重要因素。據(jù)統(tǒng)計，全世界至少有20％的耕地已經(jīng)出現(xiàn)鹽漬化。我國鹽漬化土地的面積越來越大，這一現(xiàn)狀已經(jīng)成為制約我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要環(huán)境因素之一。大豆是一種重要的油料作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)受到鹽脅迫的明顯制約。因此，選育耐鹽品種對于提高我國鹽漬化地區(qū)大豆的產(chǎn)量潛力具有非常重要的意義。耐鹽基因的定位和克隆將是促進(jìn)大豆耐鹽品種培育的有效途徑之一。
　　本研究利用包含427個家系的重組自交系群體NJRI

2、KY(科豐1號×南農(nóng)1138-2)，采用低豐度(0.8 X)的全基因組重測序技術(shù)構(gòu)建的包含4737個重組bin（分子標(biāo)記）的高密度大豆遺傳圖譜(bin map)，對大豆幼苗期的耐鹽相關(guān)性狀進(jìn)行QTL分析;同時通過耐鹽候選基因的篩選，克隆了GmRPL23和GmAKR兩個耐鹽候選基因，并對它們進(jìn)行生物信息學(xué)分析。研究結(jié)果如下:
　　1、通過水培法，在植物培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)（條件設(shè)定:白天14小時，溫度為29℃，;黑夜10小時，溫度為23℃，

3、相對濕度為70％），當(dāng)生長8天后（2天萌發(fā)+6天營養(yǎng)液培養(yǎng)），分別用含0和150mM NaCl的Hoagland溶液培養(yǎng)6天，以各家系（每個家系6株）植株在0和150mM鹽處理下的根長及干重為指標(biāo)，進(jìn)行相關(guān)QTL定位（實驗重復(fù)3次）。共統(tǒng)計4個指標(biāo)，分別為:正常生長情況下的根長即對照根長（CKRL）、正常生長情況下的干重即對照干重(CKDW);以及耐鹽指標(biāo)相對根長即處理根長與對照根長的比值（RRL）、相對干重即處理干重與對照干重的比值(

4、RDW)。結(jié)果顯示這4個指標(biāo)的遺傳率分別為64.4％、86.2％;58.7％、78.4％。
　　2、用QTL Network2.1進(jìn)行幼苗期耐鹽QTL定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以相對根長(RRL)及相對干重(RDW)作為耐鹽指標(biāo)，在1、2、4、5、6、7、9、10、11、12、15、16和18號染色體上共檢測到16個與幼苗期耐鹽性相關(guān)的加性QTL位點，可解釋的總遺傳率為25.8％，置信區(qū)間的范圍在1.1 cM-2.6cM之間。此外，以相對根長

5、（RRL）為指標(biāo)共檢測到4對上位性互作QTL，且這些互作的5個QTL（有3對重復(fù)的）均在加性QTL位點中檢測到。通過與前人已經(jīng)定位到的耐鹽QTL對比，發(fā)現(xiàn)在18號染色體（G連鎖群）上定位到的1個QTL位點（qrrl18-1）可能與Chen等(2008)定位到的1個位點（qpsdG.1）是同一個QTL，并將置信區(qū)間從21.5cM縮小至1.7cM。通過Soybase網(wǎng)站比較表明，在我們定位到的16個大豆幼苗期耐鹽QTL中，有13個QTL的附

6、近找到了已報道過的基因，且有許多都可能與耐鹽相關(guān)（如過氧化物酶、MYB、bZIP、NAC類蛋白等）。這些結(jié)果與耐鹽機(jī)制研究中發(fā)掘的耐鹽基因相吻合。分別以相對根長、相對干重以及兩者的均值排序分析424個家系的耐鹽級別，結(jié)果都檢測出WKY-133、WKY-166、WKY-348、WKY-351、WKY-397、WKY-465、WKY-481和WKY-513這8個高度耐鹽家系（耐鹽等級為1級）。
　　3、多個耐鹽QTL研究都定位到了Gm

7、03:40344151-Gm03:41800718這個區(qū)段，結(jié)合科豐1號和南農(nóng)1138-2不同組織鹽處理的RNA-seq數(shù)據(jù)（中科院遺傳研究所陳受宜老師提供），我們選擇了3號染色體上Gm03:40118992..40846377之間724.4kb的基因區(qū)段作為候選基因挖掘的重點區(qū)段進(jìn)行候選基因分析。在該區(qū)段內(nèi)預(yù)測到81個基因，其中51個基因在南農(nóng)1138-2與科豐1號之間存在SNP/Indel差異。通過功能注釋及半定量相關(guān)實驗，初步選取

8、了6個基因，其中有2個有應(yīng)答。以栽培大豆南農(nóng)1138-2根、莖、葉的mRNA為模板，采用RT-PCR方法對6個基因進(jìn)行分析，結(jié)果有2個基因在150mM NaCl脅迫下在南農(nóng)1138-2根和葉等組織中的表達(dá)量均受到誘導(dǎo)。一個基因在南農(nóng)1138-2根及葉中的表達(dá)量在鹽處理12小時后有一個明顯的上調(diào)，而在莖中表達(dá)量基本不變。另一個基因在南農(nóng)1138-2根中的表達(dá)量在6小時后有一個明顯的上調(diào)，而在葉中的表達(dá)量在鹽處理24小時后有明顯的上調(diào)，根據(jù)