槲皮素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維車(chē)胞增殖及P38MAPK、HMGB1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:采用腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞(CFs)建立增殖模型，探討槲皮素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞(CFs)增殖及P38MAPK、HMGB1表達(dá)的影響，探索槲皮素抑制心肌纖維化的分子機(jī)制，為槲皮素逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)及其開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:1.原代心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定:通過(guò)胰蛋白酶消化法，利用差速貼壁法獲得較純化的心肌成纖維細(xì)胞，用光學(xué)顯微鏡和免疫熒光法鑒定細(xì)胞。2.檢測(cè)方法:應(yīng)用MTT法檢測(cè)

2、心肌成纖維細(xì)胞的增殖，采用Western Blot法測(cè)定P38MAPK、HMGB1蛋白的表達(dá)。3.實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)藥物濃度的不同，將第3或4代心肌成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，并將實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分:第一:槲皮素對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下的心肌成纖維細(xì)胞的影響，分為五組:空白對(duì)照組以及不同濃度的槲皮素組(25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L);第二:探索TNF-α誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的濃度范圍及作用時(shí)間，根據(jù)不同濃度的TNF-

3、α分為空白對(duì)照組、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml、320ng/ml、640ng/ml組作用8小時(shí)，找到濃度范圍后再作用不同的時(shí)間0h、4h、8h、16h、32h;第三:觀察槲皮素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖及P38MAPK、HMGB1表達(dá)的影響，分為6組:空白對(duì)照組、TNF-α組、不同濃度的槲皮素（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）+TNF-α

4、組、P38MAPK抑制劑(SB203580)+TNF-α組。
　　結(jié)果:1.原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)光學(xué)顯微鏡和免疫熒光法鑒定為心肌成纖維細(xì)胞，純度在98％以上。2.槲皮素對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下的心肌成纖維細(xì)胞干預(yù)24h后并不影響心肌成纖維細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示槲皮素各濃度組(25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L)與空白對(duì)照組的OD值比較，P＞0.05，未見(jiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.TNF-α各濃度組與對(duì)照組比較，其中

5、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml濃度組OD值明顯高于對(duì)照組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α不同時(shí)間組與0h組比較，4h、8h組的OD值高于0h組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.槲皮素干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞24h后，各濃度組OD值與TNF-α組相比較，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著槲皮素濃度的增加，CFs的OD值越小;槲皮素各濃度組之間比較，P＜0.05，差

6、異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.TNF-α組P38MAPK、HMGB1的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組、槲皮素各濃度組以及SB203580組(P＜0.05)，而槲皮素各濃度組(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)，隨濃度的增加，P38MAPK、HMGB1的蛋白表達(dá)逐漸減弱，且組間比較均有差異(P＜0.05)，SB203580組P38MAPK、HMGB1的蛋白表達(dá)也明顯弱于TNF-α組。
　　結(jié)論:1.TNF-α在一定濃度、時(shí)間范