三種罕見遺傳病致病基因及機(jī)制研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 5q35.3插入導(dǎo)致X連鎖先天性全身性毛發(fā)增多癥的分子機(jī)制研究
　　目的：
　　先天性全身性毛發(fā)增多癥(congenital generalized hypertrichosis，CGH)，俗稱“狼人綜合征”(werewolf syndrome)，是一種以非雄性激素依賴的、全身性毛發(fā)（終毛，毫毛或者胎毛）過度生長(zhǎng)為主要特點(diǎn)的皮膚遺傳病，不受性別、年齡和人種限制。它被認(rèn)為是一

2、種返祖現(xiàn)象。到目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)毛發(fā)增多癥發(fā)病的分子機(jī)理的研究尚無確定性結(jié)論。
　　先天性全身性毛發(fā)增多癥的發(fā)生率可達(dá)十億分之一，其遺傳方式可呈常染色體顯性遺傳或X連鎖顯性遺傳，具有高度的表型異質(zhì)性及遺傳異質(zhì)性。有研究報(bào)道，呈常染色體顯性遺傳的單純性先天性全身性毛發(fā)增多癥可由兩種遺傳缺陷導(dǎo)致:一種是由17q24區(qū)域的拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)導(dǎo)致的伴有或不伴有牙齦增生的全身性終毛增多癥(con

3、genital generalized hypertrichosisterminalis，CGHT，OMIM135400);另一類是8號(hào)染色體的結(jié)構(gòu)重排，可能通過位置效應(yīng)致病的Ambras型先天性全身性毛發(fā)增多癥(hypertrichosis universaliscongenital,Ambras type,OMIM145701)。
　　對(duì)于X連鎖CGH，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其是一種基因組疾病，是由于Xq27.1區(qū)域內(nèi)回文序列的

4、斷裂介導(dǎo)的非同源片段插入，并提出該插入可能引入了組織特異性調(diào)控元件，影響了插入點(diǎn)附近毛囊發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)異常，從而導(dǎo)致CGH的發(fā)生?？梢傻暮蜻x基因?yàn)镾OX3基因。
　　本研究中，針對(duì)在中國(guó)家系內(nèi)發(fā)現(xiàn)的5q35.3插入導(dǎo)致X連鎖先天性全身性毛發(fā)增多癥的分子機(jī)制進(jìn)行研究。由于小鼠與人類的基因組序列同源性較高，利用小鼠模型對(duì)病理機(jī)制的探索有著其他模式生物不可替代的優(yōu)越性，因此，本研究主要運(yùn)用小鼠模型對(duì)X連鎖CGH的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究。<

5、br>　　方法：
　　1.利用UCSC內(nèi)H3K27Ac Mark分析，找到5q35.3插入片段內(nèi)可能具有調(diào)控基因表達(dá)作用的序列，分別命名為RS1及RS2。
　　2.利用原核注射方法制備兩種含lacZ報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型Hsp-lacZ-RS1及Hsp-lacZ-RS2。利用whole-mount lacZ染色的方法檢測(cè)候選調(diào)控序列的調(diào)控作用。3.利用胚胎干細(xì)胞同源重組的方法制備RS1及RS2片段定點(diǎn)敲入的小鼠模型。運(yùn)用特

6、定脫毛方法人為誘導(dǎo)使成年小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)同步化，觀察實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)進(jìn)程的差別。
　　結(jié)果：
　　1.lacZ著色部位結(jié)果提示，兩個(gè)候選調(diào)控元件RS1及RS2均具有調(diào)控基因表達(dá)的作用，并且表達(dá)位置與毛囊相關(guān)，存在組織特異性。
　　2.通過對(duì)RS1片段定點(diǎn)敲入小鼠與野生型小鼠皮膚顏色的觀察及兩種小鼠毛發(fā)再生的研究發(fā)現(xiàn)兩種小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)不同步。RS2片段定點(diǎn)敲入小鼠暫未發(fā)現(xiàn)任何異常。
　　結(jié)論：
　　5q3

7、5.3內(nèi)存在調(diào)控元件，并且該元件的插入影響了毛囊再生。
　　第二部分 一個(gè)漢族肌萎縮側(cè)索硬化癥家系的分子遺傳學(xué)研究
　　目的：
　　肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS，OMIM105400)是一種致死性的神經(jīng)退行性疾病，通常累及大腦皮質(zhì)、腦干和脊髓前角的上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，導(dǎo)致四肢肌肉無力和萎縮、言語困難及呼吸功能障礙。ALS患者發(fā)病年齡多處于30-50歲，病程緩慢，呈進(jìn)

8、行性發(fā)展，多無感覺障礙。目前，尚缺乏ALS的有效治療方案，患者一般在確診3-5年后因呼吸困難、肺部感染和全身衰竭而死亡。
　　ALS屬于罕見病(Orphan Diseases，OD)，發(fā)病率約為2-5人/10萬。目前，全世界已發(fā)現(xiàn)的ALS致病及相關(guān)基因已超過30個(gè)，其中SOD1、FUS、TARDBP和C9ORF72基因最為常見。ALS患者中約5-10％為家族性ALS(Familiar ALS，F(xiàn)ALS)，遺傳方式呈常染色體顯性遺傳

9、，少數(shù)呈X連鎖或常染色體隱性遺傳。其余約90％的ALS患者沒有家族史，稱為散發(fā)性ALS(sporadic ALS，SALS)。
　　本研究中我們收集到一個(gè)呈常染色體顯性遺傳的漢族ALS家系，通過分子遺傳學(xué)研究，以期發(fā)現(xiàn)該家系的致病突變并闡明其潛在的致病機(jī)制。
　　方法：
　　1.通過臨床檢查和家系成員既往史調(diào)查，在知情同意的情況下采集家系內(nèi)多名成員外周血液樣本，并對(duì)其進(jìn)行DNA和RNA常規(guī)提取。
　　2.利用靶向

10、重測(cè)序技術(shù)、比較基因組雜交技術(shù)、全外顯子組測(cè)序技術(shù)、全基因組測(cè)序技術(shù)依次分別檢測(cè)家系內(nèi)患者在全基因組范圍內(nèi)是否攜帶已知或相關(guān) ALS致病基因突變、大片段拷貝數(shù)的變異、編碼區(qū)的點(diǎn)突變或微插入及微缺失、家系內(nèi)候選致病基因所在染色體的倒位或易位變異。每步均結(jié)合Sanger測(cè)序或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3.利用Sanger測(cè)序檢測(cè)候選致病變異在正常人群中的發(fā)生率及其所在基因在ALS散發(fā)病例中的變異分布。
　　4.細(xì)胞水平上

11、利用western blot方法對(duì)候選致病位點(diǎn)進(jìn)行功能學(xué)研究。
　　5.利用CRISPR/Cas9制備knock in小鼠模型，做初步表型分析。
　　結(jié)果：
　　1.靶向重測(cè)序結(jié)果顯示家系內(nèi)先證者并未攜帶已知及相關(guān)的ALS致病基因變異。
　　2.比較基因組雜交技術(shù)結(jié)果顯示家系內(nèi)患者并未檢測(cè)到致病性拷貝數(shù)變異。
　　3.全外顯子組測(cè)序及家系驗(yàn)證結(jié)果顯示PLCB2 p.R1113W的變異與疾病表型共分離，并且為

12、罕見變異。
　　4.全基因組測(cè)序及家系驗(yàn)證結(jié)果提示家系內(nèi)患者并未攜帶PLCB2基因所在染色體的大片段易位或倒位變異。
　　5.在266名散發(fā)ALS患者及300名正常人中篩查PLCB2基因，結(jié)果顯示兩組人群在該基因的突變數(shù)量份布上存在顯著差異(p＜0.01)。
　　6.離體實(shí)驗(yàn)表明家系內(nèi)患者攜帶的錯(cuò)義變異并未影響PLCB2蛋白的表達(dá);散發(fā)患者中發(fā)現(xiàn)的移碼突變導(dǎo)致PLCB2基因表達(dá)量降低。
　　結(jié)論：
　　本研

13、究中，在一個(gè)常染色體顯性ALS家系中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)候選致病變異，并結(jié)合遺傳學(xué)和功能學(xué)特征進(jìn)行變異致病性判斷，提出PLCB2 p.R1113W為該家系可能的致病變異，為ALS復(fù)雜分子機(jī)制的研究提供了新的思路。
　　第三部分 發(fā)作性疾病中PRRT2基因突變分析
　　目的：
　　PRRT2基因突變是良性家族性嬰幼兒驚厥(benign familial infantile epilepsy,BFIE)、嬰兒痙攣及手足徐動(dòng)癥(inf

14、antile convulsions with choreoathetosis syndrome,ICCA)、發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性肌張力障礙(paroxysmal kinesigenic dyskinesia，PKD)最常見的致病原因。另外發(fā)熱驚厥、偏頭痛、發(fā)作性過度運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性肌張力障礙(paroxysmal exercise-induced dyskinesia，PED)和發(fā)作性非運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性肌張力障礙(paroxysmal non-kin

15、esigenic dyskinesia，PNKD)等其他發(fā)作性疾病也與該基因的突變相關(guān)。本研究中對(duì)收集到的PKD/ICCA患者及其他發(fā)作性疾病的患者進(jìn)行PRRT2基因的突變篩查，并對(duì)其進(jìn)行基因型—表型關(guān)系分析。
　　方法：
　　1.經(jīng)臨床診斷，在知情同意的前提下，收集患者及家系成員外周血樣本各4ml，EDTA抗凝。
　　2.利用Sanger測(cè)序的方法，對(duì)收集到的樣本進(jìn)行PRRT2基因的突變篩查。
　　3.利用統(tǒng)計(jì)

16、學(xué)方法對(duì)收集到的PKD/ICCA及其他發(fā)作性疾病相關(guān)患者PRRT2基因型和表型進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.共收集到10例家族性PKD/ICCA患者，31例不同發(fā)作性運(yùn)動(dòng)障礙表型的散發(fā)患者，68例不同類型癲癇和偏頭痛的患者。
　　2.在10例PKD/ICCA患者中檢測(cè)到5個(gè)PRRT2基因的突變，其中兩個(gè)為尚未報(bào)道突變。
　　3.攜帶PRRT2基因突變的PKD患者較之無突變的患者發(fā)病年齡提前。
　　4.在非