Spred-2在ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎中的保護(hù)作用.pdf

1、引言:T細(xì)胞在多種肝臟疾病的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用,如病毒性肝炎,自身免疫性肝炎,酒精性肝病和非酒精性脂肪肝病等,但是T細(xì)胞如何發(fā)揮作用及其相關(guān)細(xì)胞因子的信號(hào)調(diào)控機(jī)制仍不清楚。其中急性乙肝病毒(HBV)的清除和肝細(xì)胞的損傷是兩個(gè)不同過(guò)程,HBV清除在肝細(xì)胞損傷前就已經(jīng)完成,當(dāng)特異性殺傷性T細(xì)胞(CTL)的缺乏導(dǎo)致病毒復(fù)制不能得到有效控制時(shí),可引起大量非特異性炎性細(xì)胞,特別是非特異性CD8+T細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的趨化作用下對(duì)肝組織的廣泛浸

2、潤(rùn),這是造成肝組織大面積損傷的基礎(chǔ)。為了深入研究T細(xì)胞應(yīng)答在肝臟疾病中的作用機(jī)制,選擇和應(yīng)用與人類(lèi)肝炎發(fā)病特征相類(lèi)似的動(dòng)物肝炎模型十分必要。注射刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)誘發(fā)動(dòng)物肝炎是一個(gè)已經(jīng)建立完善的模型,這種模型的病理特征與人類(lèi)病毒性肝炎,自身免疫性肝炎和藥物性肝炎相似。ConA誘導(dǎo)的肝炎主要通過(guò)快速活化多克隆T細(xì)胞包括為CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)自身免疫損傷。其特征是血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水

3、平迅速升高,血清中含有大量細(xì)胞因子,肝臟出現(xiàn)白細(xì)胞浸潤(rùn),肝細(xì)胞壞死和凋亡。在這種由ConA誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)過(guò)度活化所引起的肝臟急性損傷模型中,T細(xì)胞的激活依賴(lài)于Th1細(xì)胞因子IFNγ及其信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　 研究表明絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)傳遞途徑在肝臟先天抗病毒防御系統(tǒng)、急性期反應(yīng)、肝臟損傷與修復(fù)中均起著重要作用。Spred(Sprouty相關(guān)的蛋白激酶

4、異構(gòu)體-1(EVH-1)domain)蛋白家族是一組與Sprouty相關(guān)的酪氨酸激酶結(jié)合蛋白,是重要的負(fù)調(diào)控因子,能夠抑制生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的活化從而下調(diào)Ras-ERK-MAPK信號(hào)通路。鑒于MAPK通路在肝臟生物學(xué)中的作用,由此推斷Spred可能在T細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟損傷中發(fā)揮重要作用。通過(guò)Northern雜交檢測(cè)小鼠各組織中的mRNA,發(fā)現(xiàn)

5、Spred-2在全身各處均有表達(dá),Spred-1僅分布于心、腦、腎、結(jié)腸等,而Spred-3特異地表達(dá)于腦組織中。
　　 課題組之前利用DNA同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)發(fā)育全能性的原理,定點(diǎn)改變小鼠基因組的序列和結(jié)構(gòu),獲得特定基因(基因組)即Spred-2被修飾的遺傳性小鼠突變模型。因此本課題將應(yīng)用基因敲除技術(shù)構(gòu)建的動(dòng)物模型對(duì)Spred-2在T細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟損傷的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究,為肝炎的治療提供新的思路和啟發(fā)。<

6、br>　　 目的:探討Spred-2在ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎中的保護(hù)作用。
　　 方法:雌性6～8周C57BL/6J(WT)小鼠和Spred-2基因敲除(Spred-2 KO)小鼠,單次靜脈注射ConA(15 mg/kg體重)后,6h、12h、24h麻醉后處死。血漿液氮凍存,肝臟生理鹽水沖洗后,一部分液氮凍存,一部分10％中性甲醛固定,另一部分0.25%膠原酶消化后分離肝臟白細(xì)胞。生化法測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶濃度;試劑盒比色法測(cè)定

7、caspase-3,8,9含量,ELISA法測(cè)定血清IFNγ濃度;應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定肝臟T細(xì)胞和NKT細(xì)胞數(shù)目;Real time PCR測(cè)定CXCL9/10,CXCR3受體,Perforin,Fas,TNF-α,IL-17 mRNA水平。
　　 結(jié)果:ConA注射12小時(shí)后,Spred-2 KO小鼠肝臟損傷較WT小鼠嚴(yán)重,血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(7476.20±1387.54 IU/L vs.3752.63±803.36 IU/L,P

8、＜0.05)濃度升高;Caspase-3,-8,-9相對(duì)值為(63.78±11.90 vs.17.35±4.48,P＜0.05;48.21±7.62 vs.8.89±1.92,P＜0.05;48.07±7.39 vs.8.23±2.36,P＜0.05)活性增加;血清IFNγ(1.89±0.18 ng/ml vs.0.81±0.22 ng/ml,P＜0.05)濃度升高,肝臟IFNγ相對(duì)值(2.57±0.49 vs.1.40±0.25,P＜

9、0.05)水平提高:流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn),Spred-2 KO小鼠肝臟CDS+T細(xì)胞數(shù)量顯著增加(8.41±2.13105/ml vs.5.15±1.18105/ml,P＜0.05),CD4+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞數(shù)量與WT小鼠無(wú)顯著差異;CXCL9/10,CXCR3受體,Perforin,Fas表達(dá)水平提高。
　　 結(jié)論:
　　 1、肝細(xì)胞損傷程度在具有Spred-2基因的野生型小鼠中較輕,肝細(xì)胞凋亡較少,提示Spred-2基因