基于DEHP風(fēng)險評估安全劑量設(shè)計(jì)的毒性研究.pdf

1、研究目的：
　　鄰苯二甲酸(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP)屬于鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)，是目前世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的增塑劑之一。由于DEHP與產(chǎn)品基質(zhì)間為非共價結(jié)合，因此隨著使用時間的推移，DEHP容易從產(chǎn)品中釋放到周圍環(huán)境造成污染，繼而通過飲水、攝食和呼吸等多種途徑進(jìn)入生物體，最終對環(huán)境和生物體健康造成危害。2011年臺灣塑化劑事件發(fā)生后，DEHP所引起的食品安全問題得

2、到了公眾的廣泛重視。2012年我國食品安全風(fēng)險評估專家委員會給出人群接觸DEHP的推薦值，認(rèn)為對于60kg體重的人來講，每天攝入3.0mg的DEHP是安全的。研究認(rèn)為，人體攝入DEHP的途徑90％來自于飲食，而飲食的攝入實(shí)際上是指用于食品的包裝材料中DEHP的含量[1-4]。因此，在即將于2017年10月19日實(shí)行的關(guān)于限制在食品接觸材料及用品中添加劑使用的新國標(biāo)(《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB9685-20

3、16)中，不僅規(guī)定DEHP在PVC材料中添加量不得超過5％，而且規(guī)定含DEHP的材料和制品不能用于接觸性脂肪性食品、乙醇含量高于20％的食品和嬰幼兒食品，且遷移量不得超過1.5mg/kg[5]。
　　雖然國標(biāo)從食品接觸材料的方面控制了DEHP的遷移量，但是目前研究報道的在醫(yī)療器材、裝修材料以及化妝品等其他材料中的遷移也不容小覷。近年來DEHP被認(rèn)定為是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental endocrine disru

4、ptors，EEDs)，能夠?qū)ι矬w的生殖發(fā)育和繁殖能力造成一定影響，關(guān)于DEHP毒性影響的研究報告也日趨增加，人們越來越關(guān)心DEHP對人體健康不造成影響的安全限量[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行DEHP的90天經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)，以風(fēng)險評估委員會推薦的DEHP的安全限量值（3.0毫克/人/天），設(shè)人的體重為60kg，即以0.05mg/kg為最低劑量，考慮到不確定系數(shù)100(10×10)，即大鼠試驗(yàn)以5mg/kg為最低劑量組，再以5mg/k

5、g的10倍、100和500倍分別設(shè)立DEHP實(shí)驗(yàn)組，即5、50、500、2500mg/kg劑量組，同時設(shè)對照組和DEHP染毒恢復(fù)組（2500mg/kg），共6組大鼠，每組20只，雌雄各半?；謴?fù)組動物停止給予DEHP后繼續(xù)觀察30天，以觀察DEHP毒性的可逆性、持續(xù)性和遲發(fā)效應(yīng)。試驗(yàn)期間至少每天觀察一次動物的一般毒性表現(xiàn)，并記錄大鼠出現(xiàn)中毒的體征、程度和持續(xù)時間及死亡情況。每周記錄體重、攝食量、計(jì)算食物利用率;進(jìn)行血液學(xué)檢查、血生化檢查等

6、常規(guī)指標(biāo)的檢測和全面的病理檢查等。為初步確定DEHP的經(jīng)口安全性、得到DEHP毒性作用的靶器官進(jìn)行DEHP對大鼠的90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)，以期得到關(guān)于DEHP毒性的安全限值，為DEHP進(jìn)一步的風(fēng)險評估奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1、DEHP亞慢性染毒對大鼠一般性指標(biāo)的影響:觀察并記錄大鼠在飼養(yǎng)期間的一般情況（如日常行為表現(xiàn)、中毒和死亡情況等）;于每周稱量記錄體重、攝食量，并計(jì)算總的食物利用率;對肝臟、腎臟、脾臟、睪丸、附睪、

7、全腦進(jìn)行解剖稱重，計(jì)算臟/體比值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2、DEHP亞慢性染毒對大鼠生化及血液學(xué)指標(biāo)的影響:取大鼠全血，并分別應(yīng)用①全自動生化儀檢測總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cre)、血清葡萄糖(GLU)、血清鉀(K)、鈉(Na)、鈣(Ca)、磷(P)、血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(CHOL)等14個生化及電解質(zhì)指標(biāo);②全

8、自動血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、直接測定的血紅蛋白濃度(CMCH)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)、血紅蛋白含量分布寬度(HDW)、血小板總數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)、中性粒細(xì)胞(NEUT)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞(BASO)、單核細(xì)胞(MONO)、淋巴細(xì)胞

9、(LYM)和未染色的大細(xì)胞數(shù)量(LUC)以及其相應(yīng)的百分比等指標(biāo)。SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果。
　　3、DEHP亞慢性染毒對大鼠精子運(yùn)動能力和腦脂質(zhì)過氧化的影響:①DEHP對大鼠精子運(yùn)動能力影響的研究:利用大鼠附睪尾精子制備精子懸液，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀(CASA)對精子的運(yùn)動參數(shù)進(jìn)行測量，包括:VCL、VSL、VAP、ALH、LIN、STR、BCF、ELON等;②DEHP對腦脂質(zhì)過氧化的影響:將腦組織利用超聲勻漿機(jī)制備成腦勻漿

10、液，離心取上清液-20℃冷凍保存，分別進(jìn)行活性氧(ROS)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)以及蛋白濃度的測定。
　　4、DEHP亞慢性染毒對大鼠組織病理學(xué)的影響:處死大鼠，迅速分離取出大鼠的肝臟、腎臟、腎上腺、脾臟、胃腸、睪丸（卵巢）、附睪及全腦，將取下的組織立即置于事先準(zhǔn)備好的10％的福爾馬林固定液中固定。制作組織病理學(xué)石蠟切片，觀察組織病理學(xué)改變。
　　研究結(jié)果:
　　1、DEHP亞慢性染毒對大鼠一般性指標(biāo)的影響:

11、在染毒期間，對照組、5、50和500mg/kg劑量組均無觀察到明顯的差異;而2500mg/kg DEHP染毒組動物則均表現(xiàn)出精神亢奮、被毛蓬松、局部脫毛（頭頸部、四肢及腹部）等中毒體征，攝食量減少，大鼠體重在染毒后顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各劑量組動物的總食物利用率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。計(jì)算大鼠的臟/體比值結(jié)果得到DEHP染毒劑量為500mg/kg時，與對照組相比大鼠的肝臟、腎臟、附睪體比值有明顯的變化

12、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);染毒劑量增加到2500mg/kg時，大鼠肝臟、腎臟、脾臟、腦、睪丸、附睪的臟/體比值與對照組比較均出現(xiàn)較大差異，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)期間2500mg/kg劑量組未出現(xiàn)大鼠死亡。
　　2、DEHP亞慢性染毒對大鼠生化及血液學(xué)指標(biāo)的影響:①血液生化指標(biāo)的影響:與肝臟、腎臟相關(guān)的生化指標(biāo)在DEHP染毒劑量為500mg/kg時開始出現(xiàn)異常;與無機(jī)鹽代謝

13、相關(guān)的生化指標(biāo)在DEHP染毒劑量為2500mg/kg時均出現(xiàn)異常;與脂類代謝相關(guān)的生化指標(biāo)中，CHOL含量在500和2500mg/kg時降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，雌、雄大鼠在各個染毒劑量組均未見TG含量異常。②血液血細(xì)胞的影響:對于白細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)，在染毒劑量為500mg/kg時，LYM上升，EOS、HGB和MCH指標(biāo)下降，在2500mg/kg時，白細(xì)胞數(shù)量減少，并且相關(guān)指標(biāo)發(fā)生改變。
　　3、DEHP亞慢

14、性染毒對大鼠精子運(yùn)動能力和腦脂質(zhì)過氧化的影響:①大鼠精子運(yùn)動能力的影響:5mg/kg劑量攝入DEHP即可影響精子運(yùn)動LIN，DEHP染毒劑量為50mg/kg時，對BCF也有影響，這表明精子的活躍程度也降低;在500mg/kg劑量組中，與對照組相比較，VAP、VSL、VCL、ALH、BCF、LIN、STR和ELON均有下降，DEHP染毒最高劑量組和恢復(fù)組中所有CASA檢測結(jié)果顯示無活動精子。②腦脂質(zhì)過氧化的影響:隨著染毒劑量的上升，ROS

15、水平先上升后下降，MDA水平隨著染毒劑量的增加不斷上升。
　　4、DEHP亞慢性染毒對大鼠組織病理學(xué)的影響:DEHP染毒5mg/kg時，僅觀察到個別大鼠器官見少量炎癥反應(yīng)，未見病理性病變;當(dāng)染毒劑量為50mg/kg大鼠的肝臟、腎臟、睪丸、附睪和卵巢均出現(xiàn)病理改變，并隨著劑量的上升病變加重;在經(jīng)過30天恢復(fù)期后，附睪未見明顯恢復(fù)。
　　研究結(jié)論:
　　通過對大鼠90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)可以得出，雄性大鼠的生殖器官是DEHP毒性

16、作用的靶器官，其中附睪對DEHP毒性作用最為敏感。試驗(yàn)得出5mg/kg的染毒劑量即可以對大鼠精子的運(yùn)動直線性有影響，并且經(jīng)過30天的恢復(fù)期，附睪的病理及各項(xiàng)檢測指標(biāo)未見任何恢復(fù)。試驗(yàn)得出DEHP對雌性和雄性大鼠的毒性作用有所差別，雌性大鼠對DEHP毒性的耐受性明顯強(qiáng)于雄性大鼠，且具有一定的遲發(fā)效應(yīng)，對雌雄大鼠的毒性耐受差異還應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行長期試驗(yàn)觀察。觀察試驗(yàn)指標(biāo)可以得到DEHP具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，多數(shù)指標(biāo)都隨著DEHP的劑量上升出