不同亞型ApoE對(duì)創(chuàng)傷后神經(jīng)元-星型膠質(zhì)細(xì)胞繼發(fā)性損傷的影響及機(jī)制探討.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)外科最常見(jiàn)的疾病之一，被認(rèn)為是全世界45歲以下人群中最具威脅的致殘、致死因素，并且給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)成為一個(gè)全球性的社會(huì)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。TBI發(fā)生后的損傷包括：原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，由于原發(fā)性損傷往往無(wú)法進(jìn)行干預(yù)，而繼發(fā)性損傷卻因?yàn)楸姸嘁蛩貐⑴c，具有多個(gè)干預(yù)靶點(diǎn)，所以繼發(fā)性損傷過(guò)程被認(rèn)為是影響TBI預(yù)后的關(guān)鍵。本課題關(guān)注的載脂蛋白E基因(apo

2、lipoprotein E gene，APOE)位于19號(hào)染色體長(zhǎng)臂，編碼腦組織中最主要的載脂蛋白--載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)。APOE共含4個(gè)外顯子，主要存在三個(gè)等位基因：APOEε2，APOEε3，APOEε4，分別編碼三種不同的ApoE，即ApoE2、ApoE3和ApoE4。這三種ApoE分子構(gòu)成的差別雖然僅限于第112和158位氨基殘基不同，但是卻導(dǎo)致3種亞型ApoE的生物學(xué)功能出現(xiàn)了明顯的差異。

3、ApoE4被認(rèn)為是功能異常的蛋白，常常扮演負(fù)性調(diào)控因子的角色，而ApoE2和ApoE3的功能則相對(duì)正常。作為腦組織最主要的載脂蛋白，ApoE不僅在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中發(fā)揮作用，還參與神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。我們的前期研究和國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)都證實(shí)APOE基因多態(tài)性能夠影響TBI的預(yù)后，但是具體機(jī)制尚不完全清楚。因此，本課題在前期工作的基礎(chǔ)上，以不同亞型ApoE蛋白在TBI后繼發(fā)性損傷過(guò)程中的作用為切入點(diǎn)，通過(guò)培養(yǎng)原代神

4、經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞并構(gòu)建機(jī)械損傷模型，檢測(cè)不同亞型ApoE對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平([Ca2+]i)、神經(jīng)元內(nèi)線粒體功能以及星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸的影響，觀察不同亞型ApoE對(duì)機(jī)械損傷后星型膠質(zhì)細(xì)胞活性和修復(fù)能力的影響以及與受體ApoER2的親和力，并探討不同亞型ApoE在TBI后的繼發(fā)性損傷過(guò)程中發(fā)揮的作用及可能方式，以期闡明APOE基因多態(tài)性影響TBI預(yù)后可能的機(jī)制。
　　一、原代神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)以及機(jī)械損傷模型的建立

5、r>　　神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織的功能和結(jié)構(gòu)中發(fā)揮極其重要的作用，所以對(duì)神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，建立穩(wěn)定的培養(yǎng)模型，對(duì)神經(jīng)科學(xué)研究至關(guān)重要；而體外神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械損傷模型可控性強(qiáng)，并能在一定程度上模擬TBI后的繼發(fā)性損傷過(guò)程，適合進(jìn)行機(jī)制方面的研究。方法：1.本部分實(shí)驗(yàn)提取出生24小時(shí)內(nèi)的APOE基因敲除小鼠(APOE-/-)的腦組織，采取酶消化法獲取細(xì)胞懸液后，分別進(jìn)行神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)。其中，神經(jīng)元的培

6、養(yǎng)基為neurobasal+B27，星型膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基為DMEM/F12+胎牛血清。2.在進(jìn)行神經(jīng)元/星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，先用傳代3次的星型膠質(zhì)細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，讓其長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部，然后將提取的原代細(xì)胞直接接種在星型膠質(zhì)細(xì)胞滋養(yǎng)層上，按照2:1的比例加入兩種培養(yǎng)基(neurobasal+B27和DMEM/F12+胎牛血清)。細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后，取狀態(tài)較好的細(xì)胞，分別選用抗GFAP和抗TubulinⅢ的抗體對(duì)星型膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記

7、，采用免疫熒光技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。3.采用移液槍槍頭作為劃傷工具，執(zhí)移液槍，在顯微鏡下對(duì)培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞進(jìn)行劃傷，并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞劃傷情況。結(jié)果：1.光鏡顯示，一種細(xì)胞呈“鋪路石”樣排列，胞體較大呈不規(guī)則形，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能被抗GFAP的抗體識(shí)別；另一種細(xì)胞胞體較小，多呈梭形，有很多較長(zhǎng)的突起，且與其它細(xì)胞的突起相互交錯(cuò)，形成網(wǎng)絡(luò)狀，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能被抗TubulinⅢ的抗體識(shí)別。2.采用免疫雙標(biāo)對(duì)細(xì)胞進(jìn)

8、行標(biāo)記后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞中部分細(xì)胞能被抗GFAP的抗體識(shí)別，另一部分細(xì)胞能被抗TubulinⅢ的抗體識(shí)別，兩種細(xì)胞相互共存。3.光鏡下可見(jiàn)由機(jī)械損傷造成的劃痕，用移液槍槍頭進(jìn)行機(jī)械劃傷可控性好。結(jié)論：本部分實(shí)驗(yàn)，成功進(jìn)行了神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)以及神經(jīng)元/星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，并且成功構(gòu)建了細(xì)胞的機(jī)械損傷模型。
　　二、不同亞型ApoE對(duì)機(jī)械損傷后星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸和神經(jīng)元線粒體膜電位以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響及可能機(jī)制

9、r>　　[Ca2+]i的變化在TBI后繼發(fā)性損傷過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用，而細(xì)胞外液中興奮性氨基酸的濃度以及細(xì)胞內(nèi)線粒體的功能變化均可能與[Ca2+]i改變有關(guān)。不同亞型的ApoE則可能通過(guò)參與這些過(guò)程，不同程度地影響[Ca2+]i。方法：本部分實(shí)驗(yàn)將神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞按照加入的ApoE均分為ApoE2組、ApoE3組、ApoE4組和沒(méi)有加入ApoE的對(duì)照組，并進(jìn)行機(jī)械劃傷，觀察機(jī)械損傷后不同時(shí)間點(diǎn)各個(gè)指標(biāo)的變化情況：1.收集機(jī)械損傷

10、后1h、2h、6h以及未進(jìn)行機(jī)械損傷的星型膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞外液，通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)各組星型膠質(zhì)細(xì)胞外液中Glu的水平。2.采用熒光探針JC－1對(duì)神經(jīng)元線粒體進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)機(jī)械損傷后1h、2h、6h、12h、24h，以及未進(jìn)行機(jī)械損傷的各組神經(jīng)元內(nèi)紅色和綠色兩種熒光的熒光強(qiáng)度比值的變化。3.采用鈣離子熒光探針Fluo－3/AM對(duì)活細(xì)胞內(nèi)鈣離子進(jìn)行標(biāo)記，選擇488nm的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)Fluo-3，在激光共聚焦顯微鏡下觀察機(jī)械

11、損傷后1h、2h、6h、12h、24h以及未進(jìn)行機(jī)械損傷的各組神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的變化。結(jié)果：1.在機(jī)械損傷2h后，加入不同亞型ApoE的星型膠質(zhì)細(xì)胞外液中Glu水平開(kāi)始出現(xiàn)差異：ApoE4組的星型膠質(zhì)細(xì)胞外液中Glu水平明顯高于ApoE2組和ApoE3組。2.在機(jī)械損傷各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，加入不同亞型ApoE的神經(jīng)元線粒體膜電位變化存在差異，ApoE4組的神經(jīng)元內(nèi)線粒體膜電位下降程度明顯高于ApoE2組和ApoE3組。3.在

12、機(jī)械損傷后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，ApoE4組的神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度均明顯高于ApoE2組和ApoE3組。結(jié)論：機(jī)械損傷發(fā)生后，不同亞型的ApoE蛋白可導(dǎo)致神經(jīng)元和星型膠質(zhì)[Ca2+]i出現(xiàn)不同變化，而這些差異有可能與ApoE對(duì)星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放Glu和神經(jīng)元線粒體膜電位的影響存在亞型特異性有關(guān)，這也可能是APOE基因多態(tài)性影響TBI預(yù)后的機(jī)制之一。
　　三、不同亞型ApoE對(duì)星型膠質(zhì)細(xì)胞修復(fù)能力和活性的影響以及與ApoER2的

13、結(jié)合情況
　　星型膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織中的作用意義重大，其活性和增殖以及修復(fù)能力能夠?qū)BI后的繼發(fā)性損傷過(guò)程產(chǎn)生重要影響。同時(shí)，ApoE作為腦組織中最主要的載脂蛋白，能夠與LDL受體家族的所有成員，包括LDLR、LRP、VLDLR和ApoER2等進(jìn)行結(jié)合，并通過(guò)這些受體發(fā)揮作用。方法：本部分實(shí)驗(yàn)將神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞按照加入的ApoE蛋白均分為ApoE2組、ApoE3組、ApoE4組和沒(méi)有加入ApoE蛋白的對(duì)照組：1.對(duì)各組星型膠質(zhì)

14、細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械劃傷，并做好標(biāo)記，在傷后24h、48h、72h進(jìn)行定點(diǎn)照相，觀察各組星型膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)損傷區(qū)域的修復(fù)情況，并采用MTT檢測(cè)各組星型膠質(zhì)細(xì)胞的活性和增殖能力。2.采用免疫雙標(biāo)，分別用抗ApoER2的抗體和抗ApoE的抗體對(duì)神經(jīng)元上的ApoER2和ApoE進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)二者熒光情況進(jìn)行合成和檢測(cè)，判斷不同亞型ApoE蛋白與ApoER2結(jié)合的情況是否存在差異。結(jié)果：1.ApoE4.組的星型膠質(zhì)細(xì)胞活性和增殖以及修復(fù)能