ETS1基因?qū)е聝煞N自身免疫性疾病易感的相關(guān)性分析及機制研究.pdf

1、強直性脊柱炎(AS)是一種常見的慢性炎癥反應(yīng)性疾病，其發(fā)生受到生活環(huán)境、免疫環(huán)境及遺傳等多種因素影響;系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)也是一類自身免疫性疾病，因其可以導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和組織損害引起患者多器官受累而一直備受關(guān)注。隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)的興起，許多自身免疫性疾病的易感基因逐漸得以揭示，越來越多的證據(jù)表明易感基因及其多態(tài)位點在復(fù)雜疾病的發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　眾所周知，ETS1作為一個經(jīng)典的原癌基因，在很多

2、侵襲性實體瘤，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和甲狀腺癌中表達(dá)都有一定程度的升高，也從側(cè)面說明這一基因?qū)τ跈C體免疫系統(tǒng)的正常維持起到至關(guān)重要的作用。盡管已有研究證明ETS1是東亞人群SLE的疾病易感基因，但是其與其他自身免疫性疾病易感性方面的作用及具體分子機制尚未可知。針對ETS1基因與AS及SLE疾病易感性的關(guān)系、導(dǎo)致在患者與正常人群中基因表達(dá)差異的原因和該基因是通過調(diào)控哪些靶基因影響免疫應(yīng)答的關(guān)鍵通路進(jìn)而參與自身免疫性疾病的發(fā)生過程這

3、幾方面的問題，我們進(jìn)行了以下三部分的研究:
　　第一部分 ETS1基因與強直性脊柱炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的關(guān)聯(lián)分析
　　為明確ETS1基因與中國北方漢族人群強直性脊柱炎疾病易感性之間的關(guān)系，本部分利用兩個人群進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，分別是2147名長期生活于山東地區(qū)的漢族人群和752名長期生活于寧夏回族自治區(qū)的漢族人群。山東地區(qū)人群中1015名強直性脊柱炎病例組個體均來自山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院及山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，診斷符合已修訂的紐約

4、強直性脊柱炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，同地區(qū)1132名對照組個體為山東大學(xué)齊魯醫(yī)院健康體檢中心同期隨機接受體檢的健康人群。寧夏回族自治區(qū)漢族人群病例組與對照組樣本均由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院楊澤教授提供。同時在兩個醫(yī)院風(fēng)濕免疫科收集無親緣關(guān)系的SLE病例組398名，同地區(qū)匹配健康對照480名作為正常對照組。根據(jù)GWAS報道及數(shù)據(jù)庫中關(guān)于中國人群該基因的連鎖不平衡情況，本研究選定了7個單核苷酸多態(tài)位點(SNP):rs12574073、rs1128334、rs493

5、7333、rs4254089、rs7951925、rs7116578及rs4937342位點用于病例-對照關(guān)聯(lián)分析。
　　利用Sanger測序排除ETS1基因新發(fā)變異后，本研究利用TaqMan探針法對所選SNP位點進(jìn)行等位基因分型，結(jié)果顯示rs12574073、rs1128334和rs4937333位點的等位基因頻率和基因型頻率在山東地區(qū)病例組和正常對照組中存在差異，但是只有rs1128334位點基因型頻率及等位基因頻率在病例組和

6、對照組中的分布具有統(tǒng)計學(xué)意義（OR=1.204,95％置信區(qū)間為1.058-1.371,P=0.005），經(jīng)過Bonferroni校正后，rs1128334位點仍與強直性脊柱炎易感性相關(guān)(Pc=0.035)。位于同一連鎖不平衡區(qū)域的rs12574073、rs1128334及rs4937333位點危險等位基因組成的TAT單體型與強直性脊柱炎發(fā)病風(fēng)險的增加顯著相關(guān)(OR值=1.24,95％置信區(qū)間為1.05-1.47,P=0.01)。隨后利

7、用寧夏回族自治區(qū)的漢族人群對rs1128334位點與強直性脊柱炎易感性的相關(guān)性進(jìn)行驗證，結(jié)果表明rs1128334位點等位基因A增加了疾病發(fā)生風(fēng)險（OR=1.305,95％置信區(qū)間為1.055-1.615,P=0.015）。
　　在SLE病例組和對照組中對rs12574073、rs1128334及rs4937333位點進(jìn)行等位基因分型，顯示3個位點與SLE疾病易感性均相關(guān)(rs12574073:OR=1.593,95％置信區(qū)間為1

8、.290-1.968,P＜0.001; rs1128334:OR=1.832,95％置信區(qū)間為1.489-2.256,P＜0.001; rs4937333:OR=1.515,95％置信區(qū)間為1.240-1.850，P＜0.001)。
　　本部分研究結(jié)果利用兩個不同地區(qū)的人群，發(fā)現(xiàn)ETS1基因是中國北方漢族人群強直性脊柱炎的易感基因，位于該基因3'非翻譯區(qū)(UTR)的rs1128334位點與疾病易感的相關(guān)性最為顯著;同時證實ETS1

9、基因在山東地區(qū)漢族人群中也與SLE疾病易感性相關(guān)。
　　第二部分 ETS1基因?qū)е录膊∫赘械墓δ芪稽c鑒定
　　通過中國北方漢族人群自身免疫性疾病AS及SLE的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，可以確定ETS1基因是這兩種自身免疫性疾病的易感基因，并且位于3,UTR的rs1128334位點與疾病易感的相關(guān)性最為顯著，那么它是否是該基因引起疾病易感的功能位點呢？根據(jù)功能位點研究策略，我們首先檢測了兩種疾病患者體內(nèi)ETS1基因的表達(dá)情況（AS病例組:

10、50例，對照組:161例;SLE病例組:47例，對照組:66例），兩種疾病病例組外周血中ETS1基因的相對表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)的對照組（P值均＜0.0001），證實ETS1基因在這兩種自身免疫性疾病的病例組和對照組中表達(dá)存在差異。
　　隨后我們檢測了rs1128334位點不同基因型健康個體(28名AA純合基因型、50名AG雜合基因型和83名GG純合基因型)ETS1基因的相對表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA基因型個體ETS1基因的相對表達(dá)水平

11、顯著低于AG基因型和GG基因型(P=0.0024)，并且表達(dá)水平隨危險等位基因A數(shù)目的增加而顯著降低。
　　通過結(jié)合歸因分析和文獻(xiàn)報道，我們發(fā)現(xiàn)rs6590330位點作為致病功能位點的可能性顯著高于rs1128334位點。數(shù)據(jù)庫中關(guān)于兩個位點連鎖不平衡性分析表明rs6590330位點與rs1128334位點處于強連鎖不平衡狀態(tài)(r2=0.97)，通過隨機對100名正常個體進(jìn)行兩位點測序比對，進(jìn)一步在我們研究的人群中證實兩者處于完全

12、連鎖不平衡狀態(tài)，因此我們將rs6590330位點作為引起疾病易感的候選功能位點進(jìn)行了研究。
　　通過雙熒光素酶報告基因活性分析，我們發(fā)現(xiàn)攜帶rs6590330位點等位基因G的報告基因活性顯著高于等位基因A，且該差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0265)。將包含等位基因A或G的序列片段與ETS1基因轉(zhuǎn)錄起始點上游842bp的片段相連，共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，結(jié)果進(jìn)一步表明rs6590330位點等位基因G能夠使ETS1基因的轉(zhuǎn)錄活性明顯增加(

13、P=0.0006)，提示rs6590330位點不同等位基因可能影響ETS1基因的表達(dá)。
　　最后，我們利用雙熒光素酶報告基因評估了轉(zhuǎn)錄因子Sp1與rs6590330位點不同等位基因結(jié)合對ETS1基因轉(zhuǎn)錄活性的影響，當(dāng)高表達(dá)Sp1時，等位基因G的轉(zhuǎn)錄活性顯著升高，而敲低Sp1的表達(dá)水平后，與對照組相比攜帶等位基因G片段的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低，但是對等位基因A沒有明顯影響，說明轉(zhuǎn)錄因子通過與等位基因G結(jié)合使ETS1基因的轉(zhuǎn)錄活性增加并影響

14、ETS1的表達(dá)。
　　本部分研究證實了在AS和SLE病例組與正常對照組中ETS1基因表達(dá)水平存在差異，提示ETS1與疾病的發(fā)生有關(guān)，對rs1128334位點功能性研究排除了其對ETS1基因表達(dá)的影響，同時證實與rs1128334位點強連鎖不平衡的多態(tài)位點rs6590330不同等位基因通過影響轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合，引起ETS1基因表達(dá)水平的改變，進(jìn)而參與疾病的發(fā)生。
　　第三部分 通過ChIP-seq初步鑒定ETS1的靶基因

15、
　　為了全面的了解ETS1在免疫細(xì)胞中的靶向調(diào)控基因，我們利用ETS1表達(dá)水平較高的黑人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Raji進(jìn)行ChIP-seq（染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合高通量測序）技術(shù)獲得與ETS1特異性結(jié)合的基因組DNA片段，通過測序及數(shù)據(jù)庫比對得到與該蛋白結(jié)合的片段序列，隨后采用MACS軟件檢測富集信號的峰度并定位其在基因組中的位置。結(jié)果表明ETS1的靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點在染色體中的分布趨勢與染色體基因組容量一致，主要分布于第1、2

16、、3、4、5、6、7號染色體上。ETS1在基因組中的靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點與臨近基因轉(zhuǎn)錄起始點(TSS)位置之間的關(guān)系為:13.37％位于TSS上游2 kb-20 kb之間（上游區(qū)域）、6.44％位于TSS上游2kb到下游2kb(啟動子區(qū)域)、45.92％位于TSS上游20 kb以外（基因間區(qū)域）、32.64％位于內(nèi)含子區(qū)域，而僅有1.64％位于外顯子中，說明ETS1既可以調(diào)控靶基因的基本啟動子活性，又可以通過特異性結(jié)合在遠(yuǎn)距離調(diào)控區(qū)域影響靶

17、基因表達(dá)。應(yīng)用GO聚類分析方法對靶基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)ETS1對參與細(xì)胞的代謝過程、生物合成、基因表達(dá)、細(xì)胞器構(gòu)成、核酸結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶的合成有關(guān)的基因均可能存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。通過KEGG通路分析提示ETS1對TRAF5、CREB3L4、CXCL5、TAB2、CREB5和CREBL2基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，提示ETS1可能通過TNF信號通路參與淋巴細(xì)胞死亡過程。
　　針對位于啟動子區(qū)域的靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點的分析結(jié)果，我們隨機選取了10個

18、候選靶基因在Raji細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行ChIP實驗驗證，結(jié)果表明ETS1可以與CDK9、YY1、IL-17RA、SOX4、CXCR5、PTPN12及GMPR2基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域結(jié)合。
　　本部分我們通過ChIP-seq技術(shù)初步鑒定得到多個與免疫系統(tǒng)功能相關(guān)的ETS1靶基因，ETS1通過對這些靶基因表達(dá)的調(diào)控，影響免疫應(yīng)答過程的多個通路，參與自身免疫反應(yīng)的過程;對淋巴細(xì)胞中ETS1靶基因進(jìn)行全面的分析也為臨床研究中自身免疫性疾病治療靶點