靜電紡絲載洛伐他汀抗骨質(zhì)疏松復(fù)合支架“eLTPS”的制備和體內(nèi)外性能研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是在脊柱外科領(lǐng)域最常見和最具挑戰(zhàn)的合并癥之一。由于骨量減少與結(jié)構(gòu)異常，合并骨質(zhì)疏松癥的患者發(fā)生椎間融合器沉降、椎體切割、螺釘拔出、（假關(guān)節(jié)形成導(dǎo)致）釘棒斷裂等內(nèi)固定失敗的例子并不罕見。由各種因素造成的成骨細(xì)胞增殖分化功能的下降，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松患者在骨修復(fù)過程中的愈合能力減弱，愈合時(shí)間延長。因此，骨質(zhì)疏松條件下的缺損修復(fù)理想上需要長時(shí)間的藥物干預(yù)。傳統(tǒng)的系統(tǒng)給藥模式存在利用率相對(duì)低下的缺點(diǎn);進(jìn)入全身循環(huán)的藥物，長期的反復(fù)作用還可能

2、升高或直接導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝腎功能損害、鈣劑相關(guān)心臟疾病等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn);同時(shí)，除了缺損部位的骨填充材料需求，脊柱外科臨床往往還需要應(yīng)用額外的骨組織來幫助實(shí)現(xiàn)節(jié)段融合。因此，通過設(shè)計(jì)出兼具長期局部控釋抗骨質(zhì)疏松藥物以及良好生物力學(xué)強(qiáng)度的復(fù)合骨支架材料，可以在對(duì)局部骨缺損支撐填充的同時(shí)，使藥物在局部微環(huán)境中持續(xù)作用，則能更好的促進(jìn)骨質(zhì)疏松條件下的骨修復(fù)并改善局部骨組織的強(qiáng)度。
　　近年來，他汀類被發(fā)現(xiàn)具有抑制成骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)成骨細(xì)胞分

3、化，促進(jìn)成骨修復(fù)，以及抑制甲羥戊酸途徑從而抑制破骨細(xì)胞的分化并調(diào)節(jié)其相關(guān)功能的作用，因此被廣泛認(rèn)為具有重要的促進(jìn)骨組織修復(fù)的以及抗骨質(zhì)疏松的潛能。然而，他汀類的骨親和力低，局部應(yīng)用發(fā)揮成骨效力又具有濃度依賴性，因此需要選擇適宜的的局部緩釋載體。近年來，靜電紡絲作為緩釋藥物的載體受到青睞，其優(yōu)勢(shì)在于經(jīng)濟(jì)便捷，載藥容量高，生物相容性好;藥物緩釋持久有效且精確可控。因此，以靜電紡絲作為抗骨質(zhì)疏松藥物的載體具有良好的潛力。然而，盡管靜電紡絲本身

4、可以形成組織支架，但難以作為可以填充支撐的骨組織支架獨(dú)立應(yīng)用，需要與傳統(tǒng)骨組織工程支架相聯(lián)合應(yīng)用。
　　本研究通過靜電紡絲技術(shù)，將他汀類藥物（洛伐他汀Lovastatin，LOV）與高分子聚合物(聚己內(nèi)酯PCL)搭載形成可緩釋LOV的載藥納米紗的膜片，再與β磷酸三鈣(β-TCP)與PCL結(jié)合形成的的復(fù)合骨支架材料，以多層“三明治”的形式裝配形成可長期緩釋載抗骨質(zhì)疏松藥物的支架復(fù)合物(eLTPS)。通過調(diào)節(jié)他汀類載藥膜片裝載層數(shù)，精

5、確控制局部微環(huán)境的藥物釋放，并在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化和證實(shí)其促進(jìn)成骨礦化的能力，并將優(yōu)化篩選的eLTPS直接應(yīng)用于兔的骨質(zhì)疏松動(dòng)物骨缺損模型中進(jìn)行外科治療，從而進(jìn)一步驗(yàn)證其體內(nèi)的抗骨質(zhì)疏松以及骨修復(fù)的能力。以期為骨質(zhì)疏松條件下骨組織缺損的局部修復(fù)提供一個(gè)新的有效途徑。
　　第一部分:可緩釋抗骨質(zhì)疏松藥物骨組織支架復(fù)合物eLTPS的制備及表征
　　目的:通過靜電紡絲技術(shù)制備可緩釋具有抗骨質(zhì)疏松藥物的骨組織支架復(fù)合物eLTPS，并

6、觀察測(cè)量其物理化學(xué)特征，以及表面微觀結(jié)構(gòu)情況。
　　方法:將LOV與PCL溶液在靜電紡絲技術(shù)輔助下制備出共混紡納米紡紗膜片“eLOV/PCL”，再與物理優(yōu)化性能后的β-TCP/PCL支架通過壓配形成e-LOV-PCL/β-TCP/PCL復(fù)合骨組織支架(eLTPS)。以萬能力學(xué)測(cè)試機(jī)檢測(cè)并優(yōu)化復(fù)合骨支架材料的抗壓性能，以掃描電鏡觀察復(fù)合支架表面的微觀結(jié)構(gòu)，以EDS能譜儀檢測(cè)材料的化學(xué)構(gòu)成。
　　結(jié)果:在靜電紡絲技術(shù)輔助下，我們

7、成功制備了載抗骨質(zhì)疏松藥物的復(fù)合骨支架材料eLTPS。各組材料樣本的抗壓性能良好，強(qiáng)度均超過70 MPa，其中β-TCP和PCL的比例為1:1時(shí)，抗壓性能較其它組更佳(P＜0.05); EDS能譜進(jìn)一步證實(shí)了材料的化學(xué)構(gòu)成;電鏡顯示制備的支架材料表面粗糙，大量分布著可供細(xì)胞黏附生長的左右的孔隙，孔隙分布均勻，大小較為均一，孔隙直徑約在250-350μm之間。
　　結(jié)論:通過靜電紡絲技術(shù)實(shí)現(xiàn)了抗骨質(zhì)疏松藥物洛伐他汀的精確搭載，在聯(lián)合

8、應(yīng)用β-TCP/PCL復(fù)合支架材料后，成功制備出了具有三維多孔結(jié)構(gòu)的骨組織支架復(fù)合物eLTPS。eLTPS裝載不同層數(shù)的靜電紡絲載藥膜片，同時(shí)兼具有一定的生物力學(xué)強(qiáng)度，理論上適用于骨質(zhì)疏松條件下骨組織缺損的局部修復(fù)。
　　第二部分:eLTPS的體外緩釋性能，生物安全性檢測(cè)以及對(duì)成骨細(xì)胞分化功能的影響
　　目的:本部分旨在研究eLTPS的藥物緩釋特性，檢測(cè)其材料的生物安全性，以及eLTPS在體外對(duì)成骨細(xì)胞增殖和成骨功能的影響。

9、
　　方法:將eLTPS置于體外模擬液中，以紫外線分光光度計(jì)(UV法)測(cè)定緩釋液中LOV的濃度，檢測(cè)49天，比較含有不同載藥絲膜層數(shù)eLTPS緩釋LOV的特性，并繪制釋放曲線。將eLTPS與對(duì)照組和MC3T3共培養(yǎng)后，以CCK-8法檢驗(yàn)eLTPS以及各對(duì)照組對(duì)鼠顱頂成骨細(xì)胞MC3T3增殖能力的影響，通過堿性磷酸酶染色以及定量分析來檢測(cè)eLTPS對(duì)成骨礦化功能的影響，以掃描電鏡動(dòng)態(tài)觀察成骨細(xì)胞在eLTPS上的黏附情況。
　　結(jié)

10、果:各組eLTPS在前3天的釋放量達(dá)20％左右，隨后各組材料LOV的釋放速率逐漸減緩。載3層靜電紡絲載藥膜片的eLTPS樣本具有更平緩而穩(wěn)定的釋放曲線，直至測(cè)量第49天時(shí)LOV釋放量僅為62.5％，仍具備37.5％左右剩余的儲(chǔ)備載藥量，LOV的有效釋放時(shí)程可達(dá)到49天以上。eLTPS組和對(duì)照組MC3T3的總體生長情況良好，培養(yǎng)第1天時(shí)，由于LOV短暫爆發(fā)釋放的影響，eLTPS組細(xì)胞存活率較對(duì)照組稍降低，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著培養(yǎng)時(shí)間

11、的延長，eLTPS組標(biāo)本成骨細(xì)胞增殖水平逐漸升高。細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)為1級(jí)，制備材料具有良好的生物相容性。堿性磷酸酶染色顯示eLTPS組的堿性磷酸酶活性最高(P＜0.05)，染色呈深藍(lán)色。掃描電鏡顯示成骨細(xì)胞在與eLTPS在共培養(yǎng)1天時(shí)即開始出現(xiàn)聚集和表面黏附，細(xì)胞伸展性良好。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，生長黏附的細(xì)胞逐漸增多，并長入材料孔隙內(nèi)部，細(xì)胞周圍可見分泌的基質(zhì)形成。
　　結(jié)論:eLTPS具有理想的長程有效控釋LOV的能力。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證

12、明了eLTPS具有良好的生物相容性，堿性磷酸酶檢測(cè)提示材料具有良好的促進(jìn)成骨分化和礦化功能。掃描電鏡證實(shí)了成骨細(xì)胞在eLTPS中的黏附生長的能力。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果初步驗(yàn)證了eLTPS作為載抗骨質(zhì)疏松骨支架材料促進(jìn)局部骨組織愈合的潛能。
　　第三部分:eLTPS在骨質(zhì)疏松性骨缺損模型中的體內(nèi)成骨作用研究
　　實(shí)驗(yàn)一:骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的建立和驗(yàn)證
　　目的:構(gòu)建不可逆的兔骨質(zhì)疏松模型，并驗(yàn)證模型構(gòu)建的有效性。
　　

13、方法:選擇新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過雙側(cè)卵巢切除和小劑量激素注射聯(lián)合應(yīng)用（OVX+MPi法），構(gòu)建不可逆的中型骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。通過Micro-CT檢測(cè)模型和對(duì)照組兔股骨下段興趣區(qū)域的骨參數(shù)變化，驗(yàn)證骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建情況。
　　結(jié)果:所有動(dòng)物模型都存活，無嚴(yán)重不良并發(fā)癥。Micro-CT結(jié)果顯示OVX+MPi組骨組織皮質(zhì)變薄，骨小梁稀疏，結(jié)構(gòu)更細(xì)，骨小梁之間的分離程度增大。實(shí)驗(yàn)組骨參數(shù):Tn=0.67±0.061/mm(P＜0.

14、001)，Tb.Th=0.14±0.01 mm(P＜0.01)，BV/TV％=13.89％±1.07％(P＜0.05)，BMD=161.74±11.58 g/cc(P＜0.001)。 OVX+MPi組的各組Micro-CT測(cè)得的各關(guān)鍵骨組織參數(shù)都低于作為對(duì)照的假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。參考既往文獻(xiàn)，可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組骨質(zhì)疏松新西蘭兔模型構(gòu)建成功。
　　結(jié)論:我們通過OVX+MPi法制備了不可逆的骨質(zhì)兔骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。以Micro

15、-CT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨組織標(biāo)本的微觀結(jié)構(gòu)和定量分析參數(shù)，驗(yàn)證了該模型的成功構(gòu)建。
　　實(shí)驗(yàn)二:eLTPS在兔骨質(zhì)疏松模型中的體內(nèi)成骨作用研究
　　目的:在制備的兔骨質(zhì)疏松模型體內(nèi)驗(yàn)證eLTPS對(duì)骨質(zhì)疏松性骨缺損的成骨修復(fù)能力。
　　方法:以前兔骨質(zhì)疏松模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按所制備eLTPS材料的形狀截骨制備股骨下段干骺端負(fù)重區(qū)域的的骨組織缺損，分別植入eLTPS組和對(duì)照組。術(shù)后4周和12周時(shí)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安樂死并取得股骨下

16、段標(biāo)本，肉眼觀察研究各組標(biāo)本的大體形態(tài)，以Micro-CT檢測(cè)各組標(biāo)本微觀結(jié)構(gòu)和興趣區(qū)域的骨參數(shù)變化情況，以硬組織切片和甲苯胺藍(lán)染色、HE染色觀察各組標(biāo)本的組織形態(tài)學(xué)特征。
　　結(jié)果:術(shù)后所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均存活，無特殊不良并發(fā)癥發(fā)生。肉眼觀見eLTPS和對(duì)照組在12周時(shí)都獲得骨性愈合。Micro-CT結(jié)果顯示eLTPS組材料周圍骨小梁數(shù)量更多，排列形態(tài)相對(duì)更好。eLTPS組標(biāo)本的關(guān)鍵骨參數(shù)獲得了一定程度的改善，優(yōu)于對(duì)照組。組織形態(tài)學(xué)結(jié)

17、果顯示材料生長情況良好，周圍未見明顯的炎性組織反應(yīng)。相對(duì)與對(duì)照組，eLTPS組材料周圍新骨組織長入明顯更多，周圍骨小梁數(shù)量更多，結(jié)構(gòu)和排列良好，材料內(nèi)部也有更多的新骨組織長入替代原材料和血管生成。
　　結(jié)論:在兔骨質(zhì)疏松骨缺損動(dòng)物模型中，eLTPS組和對(duì)照組獲得了不同程度的骨修復(fù)愈合結(jié)果。eLTPS組獲得了更好的骨組織微觀結(jié)構(gòu)和良好的骨參數(shù)改善。組織形態(tài)學(xué)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證eLTPS組有更理想的局部新生骨長入能力。綜上所述，可以認(rèn)為e