白腐真菌木質(zhì)素降解酶的合成、定點(diǎn)突變、畢赤酵母表達(dá)以及它們對(duì)造紙工業(yè)中木質(zhì)纖維原料降解的研究.pdf

1、造紙工業(yè)是污染非常嚴(yán)重的行業(yè)之一，減少造紙行業(yè)污染的關(guān)鍵是木質(zhì)素的有效降解。漆酶(lacease)、錳過(guò)氧化物酶(manganese peroxidase)、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(Lignin peroxidase)是三種主要的木質(zhì)素降解酶，它們組成的復(fù)合酶系是自然界中最高效的降解木質(zhì)素的酶系。本研究對(duì)這三種酶的分子改造、酵母表達(dá)、分離純化、酶學(xué)性質(zhì)和對(duì)木質(zhì)素的降解效果進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為今后將其應(yīng)用于造紙工業(yè)的制漿和漂白過(guò)程提供了理論和實(shí)

2、踐依據(jù)。 針對(duì)目前主要的幾種基因合成方法具有步驟復(fù)雜、耗時(shí)、出錯(cuò)率高、費(fèi)用昂貴等弊端，我們運(yùn)用OE-PCR技術(shù)和DNA Works軟件，通過(guò)采用40nt長(zhǎng)的引物、分散基因中的AT堿基、提高退火溫度、使用高保真的PrimerSTAR DNA聚合酶等措施，成功建立了一個(gè)基因合成與定點(diǎn)突變平臺(tái)。該平臺(tái)不但可以簡(jiǎn)單、快速、低成本地合成任何已知序列的基因，而且可以極大地減少基因合成中堿基的缺失和突變。此外，運(yùn)用該平臺(tái)還可以很容易地實(shí)現(xiàn)基因

3、的定點(diǎn)突變。在本研究中，我們應(yīng)用這個(gè)平臺(tái)成功合成了具有酵母密碼子偏好性的黃孢原毛平革菌錳過(guò)氧化物酶和灰蓋鬼傘菌過(guò)氧化物酶。在研究工作中，為了從沒(méi)有藍(lán)白反應(yīng)的克隆中篩選到所需的轉(zhuǎn)化子，我們?cè)诮?jīng)典的堿裂解法基礎(chǔ)上發(fā)展了一種用NaOH一步裂解法篩選重組子的快速鑒定方法，該方法快速而簡(jiǎn)單，可以高通量地從轉(zhuǎn)化平板中篩選到所需的重組克隆，尤其適合篩選高拷貝、沒(méi)有藍(lán)白反應(yīng)的重組克隆。上述兩個(gè)技術(shù)平臺(tái)的建立為本課題的順利開(kāi)展提供了技術(shù)保障。 野

4、生的灰蓋鬼傘菌過(guò)氧化物酶(Cip)酶活低，并且在高溫、高pH情況下容易失活，這給它在造紙工業(yè)上的應(yīng)用帶來(lái)了限制。我們根據(jù)文獻(xiàn)上的報(bào)道，利用上面建立的技術(shù)平臺(tái)對(duì)野生型的Cip基因進(jìn)行了一系列定點(diǎn)突變，并分別獲得了具有4、6、7個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)的Cip突變酶基因。我們將上述野生酶和突變酶基因分別連接到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA上，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，獲得了重組Cip酶和突變Cip酶。對(duì)這些酶酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，野生型酶在表達(dá)的

5、第五天達(dá)到最大值，1.519955×105IU/L，最適反應(yīng)pH2.2，最適反應(yīng)溫度45℃，pH＞3時(shí)酶活和酶穩(wěn)定性迅速下降，30-80℃度都不穩(wěn)定。突變酶的酶學(xué)特性都有都有不同程度改善，其中整體酶學(xué)特性最好的突變酶是cipmt7，它在第六天表達(dá)酶活最高，為2.74836×10SIU/L，最適反應(yīng)pH為3.4，向中性pH值方向偏移2.2單位，pH2.2-5.6之間活性在60％以上，反應(yīng)pH范圍和野生相比向中性pH值方向偏移了2.6個(gè)單位

6、，在pH5.6時(shí)野生型酶活性幾乎為0，而cipmt7仍有61％的活性，在pH4.0時(shí)25℃保溫7個(gè)小時(shí)，野生型的酶活只剩下30％，而cipmt7仍有60％活性，高溫穩(wěn)定性也有大幅度的提高。 錳過(guò)氧化物酶(Mnp)是木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶之一，在紙漿生物漂白、有機(jī)污染物降解、染料脫色、褐煤生物降解等方面有著廣泛應(yīng)用。但是利用白腐真菌發(fā)酵獲得Mnp，周期長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求高，得率低不適合工業(yè)應(yīng)用。我們利用上面建立的基因合成技術(shù)平臺(tái)將Mnp基因

7、進(jìn)行了酵母密碼子的最適化，然后重組到畢赤酵母中進(jìn)行大量表達(dá)，并對(duì)重組酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。結(jié)果表明重組酶的酶活為誘導(dǎo)96小時(shí)活性最高，達(dá)2.565432×105IU/L，最適pH為3.6，pH＞4時(shí)酶活和pH穩(wěn)定性迅速下降，最適反應(yīng)溫度為40℃，30-50℃比較穩(wěn)定，50℃保溫1小時(shí)活性剩余50％。 漆酶(Lac)也是一種重要的木質(zhì)素降解酶。在造紙工業(yè)中應(yīng)用漆酶的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)是如何獲得大量的、廉價(jià)的漆酶資源及如何提高漆酶

8、在工業(yè)環(huán)境下降解木質(zhì)素的能力。利用畢赤酵母高效表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行異源表達(dá)是提高漆酶產(chǎn)量的一條有效途徑。但我們獲得的天然云芝漆酶基因中含有過(guò)多的酶切位點(diǎn)，給重組表達(dá)載體的構(gòu)建及線(xiàn)性化帶來(lái)很大的不便。為此我們根據(jù)密碼子的擺動(dòng)性和酵母密碼子的偏好性設(shè)計(jì)了引物對(duì)該基因進(jìn)行改造，去掉基因內(nèi)部的EcoRI，SacI位點(diǎn)，在5'端加上EcoRI，3'端加上XbaI位點(diǎn)。然后構(gòu)建表達(dá)載體將將基因重組到畢赤酵母中大量表達(dá)，并對(duì)重組酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)地研究。