青蝦RNAi技術(shù)的研究及其在蛻皮抑制激素(MIH)基因功能研究中的應(yīng)用.pdf

1、青蝦，學(xué)名日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)，是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類。其在分類上屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)，甲殼綱(Crustacea)，十足目(Decapoda)，長臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)。近年來，隨著青蝦遺傳育種工作的開展，已有大量與性別和生殖相關(guān)的基因被克隆并進(jìn)行了表達(dá)分析，但是對于這些基因的功能研究仍缺少有效的手段。RNA干擾(RNA

2、interference，RNAi)技術(shù)是一種重要的基因功能研究手段，已在多種甲殼動物功能基因的研究中應(yīng)用，然而該技術(shù)在青蝦研究工作中的應(yīng)用還鮮有報道。在青蝦中建立RNAi的方法，將為青蝦基因功能的研究開辟一條新的路徑。本研究用實(shí)驗(yàn)室已克隆的青蝦transformer-2(Mntra-2)基因進(jìn)行青蝦RNAi技術(shù)的研究，然后將RNAi技術(shù)應(yīng)用到新克隆的青蝦蛻皮抑制激素(molt-inhibiting hormone，MIH)基因的功能研

3、究中。
　　在Mntra-2基因中研究了RNAi的最佳注射部位、注射劑量以及干擾規(guī)律。通過對肌肉、心臟、圍心腔和眼柄基部四個注射部位的比較，確定圍心腔為最適宜注射部位。采用該方法進(jìn)行時間依賴性實(shí)驗(yàn)和不同劑量(0.4μg/g、4μg/g和12μg/g)干擾規(guī)律的實(shí)驗(yàn)。利用熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測干擾后tra-2基因mRNA表達(dá)量的變化。時間依賴性實(shí)驗(yàn)表明RNAi效果會隨著時間的變化而變化。0.4μg/g的注射劑量不能起到

4、干擾效果，4μg/g和12μg/g的劑量干擾效果顯著，均能使目的基因的表達(dá)量下降80％左右，tra-2 mRNA的表達(dá)量均呈現(xiàn)先下降后恢復(fù)的規(guī)律。4μg/g的注射劑量在第7天使目的基因的表達(dá)量降為最低，14天基本恢復(fù)到和對照組持平。12μg/g的劑量在第5天使目的基因的表達(dá)量降為最低，干擾效果持續(xù)時間更長，在第14天時表達(dá)量恢復(fù)到對照組的60％。
　　采用快速擴(kuò)增cDNA末端(rapid-amplification of cDNA

5、 ends，RACE)技術(shù)克隆了青蝦MIH基因的全長cDNA序列。青蝦MIH基因cDNA序列全長925bp，開放閱讀框(ORE)為360bp，共編碼119個氨基酸多肽前體，由信號肽(41個氨基酸)和成熟肽(78個氨基酸)組成。青蝦MIH的氨基酸序列比對分析表明其與羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)和普通黃道蟹(Cancer pagurus)的相似性均達(dá)到90％以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，青蝦MIH基因的氨基酸序列

6、與淡水蟹類的遺傳距離較近。采用qRT-PCR技術(shù)分析了青蝦MIH基因的時空表達(dá)。結(jié)果表明，MnMIH基因在卵裂期的表達(dá)量高，隨后下降，潘狀幼體期隨著眼點(diǎn)的發(fā)育的MnMIH基因表達(dá)量升高，在出膜第一天達(dá)到一個表達(dá)高峰。幼體期表達(dá)量最低，幼蝦期隨蛻皮周期出現(xiàn)規(guī)律性的波動。青蝦MIH基因在眼柄、腹神經(jīng)、精巢、肌肉、鰓、心臟、腦、卵巢、肝臟9種組織中的表達(dá)結(jié)果顯示，青蝦MIH基因在眼柄中的表達(dá)量最高，其次是腹神經(jīng)節(jié)、鰓、卵巢和腦，在其余組織中表

7、達(dá)量極低或不表達(dá)。蛻皮周期中MIH基因表達(dá)量的變化檢測結(jié)果表明，MIH基因在蛻皮前表達(dá)量下降到最低，蛻皮后表達(dá)量迅速上升，蛻皮間期維持高表達(dá)。
　　根據(jù)已建立的RNAi技術(shù)用4μg/g的劑量，圍心腔注射法對青蝦MIH基因功能進(jìn)行研究。qRT-PCR檢測結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組mRNA的表達(dá)量的變化規(guī)律和tra-2基因相同，均呈現(xiàn)先下降后恢復(fù)的趨勢。也在第6～8天下降到最低水平，降低92％(P＜0.05)，與tra-2基因相比干擾效果更顯著。

8、連續(xù)性干擾實(shí)驗(yàn)在冬季進(jìn)行，將同期發(fā)育的青蝦分為四組:雄蝦干擾組和對照組;雌蝦干擾組和對照組。用4μg/g注射劑量，每7天對各組蝦進(jìn)行一次補(bǔ)充注射，記錄6周內(nèi)各組蝦的蛻皮頻次和體重變化。結(jié)果表明，RNAi能顯著增加青蝦的蛻皮頻次，干擾雄蝦和雌蝦分別蛻皮17次、12次，而對照組雄、雌蝦則為2次、5次。實(shí)驗(yàn)后雄蝦干擾組的體重比實(shí)驗(yàn)前增加了0.26g(P＜0.05)，雄蝦對照組、雌蝦干擾組和對照組的體重分別增加了0.06g、0.08g和0.04