GC-MS法測定生物樣品中有毒陰離子的研究.pdf

1、目的：由于氰化物和亞硝酸鹽具有廣泛存在性和劇毒性,它們一直是我國中毒案件中常見的毒物。氰化物和亞硝酸鹽的毒性主要由其分子在機體內(nèi)釋放出的無機陰離子-CN-和NO2-所引起,故其毒性強弱也主要取決于釋出陰離子的含量。因此快速準確地檢測生物樣品中游離的CN-和NO2-,在毒物分析以及臨床醫(yī)學研究中具有重要的實際應用價值。測定CN-和NO2-的方法有分光光度法、電化學法和色譜法。其中,氣相色譜/質(zhì)譜法(GC/MS)綜合了氣相色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點,

2、具有靈敏度高、分析速度快和鑒別能力強的特點,可完成復雜生物樣品中痕量組分的定性和定量分析,在生物樣品分析中占有重要地位。但由于CN-和NO2-離子系水溶性無機陰離子,其強極性、水溶性和無揮發(fā)性限制了氣相色譜/質(zhì)譜在測定生物樣品中CN-和NO2-離子的應用。本實驗的目的就是探索通過對生物樣品進行一系列的前處理,對無機陰離子進行濃縮富集,使其轉(zhuǎn)換成極性小、揮發(fā)性強的物質(zhì),進行氣相色譜/質(zhì)譜分析,實現(xiàn)生物樣品中無機陰離子的快速、準確分析。

3、r>　　 方法:
　　 1、GC/MS法測定血漿和尿中CN-的含量。在0.5mL血漿或尿中,加入0.5mL硼砂緩沖溶液(pH=10),加入5μL,0.1μg·μL-1(共計0.5μg)三溴苯(內(nèi)標);向上述溶液中加入苯甲醛,渦旋振蕩30s后,靜置5min;在15cm(高)×1.0cm(內(nèi)徑)的玻璃層析柱底端填入少許脫脂棉,然后填入1.5g硅藻土;將上述溶液轉(zhuǎn)移至硅藻土柱中,靜置10min;用混合溶液(5mL正己烷+20μL H

4、FB-Cl)洗脫,同時完成第二步衍生化;將脫出液置于通風櫥內(nèi),N2下濃縮至近干,吸取1μL于GC/MS分析。
　　 2、GC/MS法測定血漿和尿中NO2-的含量。在0.5mL血漿或尿中,加入1mL磷酸緩沖溶液(pH=3),分別加入衍生化試劑2,3-DAN溶液和1,8-DAN溶液20μL,密封,渦旋震蕩30秒,于60℃水浴中加熱10min,冷卻后,加入內(nèi)標SKF525A(0.1mg·mL-1)5μL;緩慢加入0.5g碳酸銨至上述溶

5、液中,調(diào)pH至8.5,渦旋振蕩.30s,直至CO2完全釋放;向上述溶液中加入2mL,乙酸乙酯萃取,震蕩1min,3500r/min離心5min;取上清液N2氣下濃縮至近干,吸取1μL進行GC/MS分析。
　　 結(jié)果:生物樣品中的CN-和NO2-經(jīng)衍生化處理后,不僅改善了色譜行為,減小或消除了極性大的物質(zhì)可能產(chǎn)生的拖尾,還提高了檢測器對被測物的靈敏度,降低了目標物的檢測限,衍生化產(chǎn)物和內(nèi)標在設定的色譜質(zhì)譜條件下得到很好的分離且沒有

6、干擾,實現(xiàn)了生物樣品中CN-和NO2-的快速、準確分析。在血漿樣品中CN-的LOD為0.04μg·mL-1,NO2-LOD為0.005μg·mL-1(2,3-DAN衍生化),NO2-LOD為0.01μg·mL-1(1,8-DAN衍生化);尿樣品中CN-的LOD為0.01μg·mL-1,NO2-LOD為0.001μg·mL-1(2,3-DAN衍生化),NO2-LOD為0.005μg·mL-1(1,8-DAN衍生化)。該方法的線性關(guān)系、精密

7、度、回收率均較好,衍生化產(chǎn)物在24h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。其中,NO2-測定中,2,3-DAN衍生化法在方法學方面優(yōu)于1,8-DAN衍生化法。
　　 討論:根據(jù)文中衍生物的色譜以及質(zhì)譜特征,分別討論了CN-和NO2-衍生化反應的機理:CN-測定中涉及到兩步衍生化反應,第一步衍生化為苯甲醛與CN-的親核加成反應,第二步衍生化為上述產(chǎn)物與七氟丁酰氯的親核取代反應;NO2-測定中,二氨基萘和亞硝酸根離子發(fā)生重氮化反應,然后與萘環(huán)上的另一個氨

8、基進行分子內(nèi)縮合成環(huán),生成偶氮亞氨基雜環(huán)化合物。文中分別探索了CN-和NO2-衍生化反應過程中的影響因素:CN-測定中,討論了樣品pH值、氰離子和苯甲醛柱前反應時間、苯甲醛用量對衍生化反應的影響,最終確定pH值為10、氰離子和苯甲醛柱前反應時間為5rain、苯甲醛為5μL時衍生化產(chǎn)物的響應值最大;NO2-測定中,討論了樣品pH值、衍生化溫度、反應時間對衍生化反應的影響,最終確定pH值為3、在60℃下反應10min時衍生化產(chǎn)物的響應值最大

9、。文中分別對質(zhì)譜及色譜圖進行了解析,探索了衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜裂解規(guī)律,并對色譜圖中的主要峰進行歸屬分析。文中討論了在CN-測定中硅藻土柱的作用機理,即固相支持的液/液萃取,該方法集提取、衍生化、洗脫為一體,不僅簡化了實驗過程,而且縮短了分析時間。文中分別將兩種方法與文獻方法進行比較,證實本方法耗時更短、精密度和準確度更高、操作更加簡便安全。
　　 結(jié)論:本文探索了GC/MS測定生物樣品中有毒陰離子CN-和NO2-的實驗方法。通過優(yōu)