共培養(yǎng)條件下脂肪干細胞成骨能力的改變.pdf

1、目的：
　　以體外培養(yǎng)的經成骨誘導后的脂肪間充質干細胞（iASCs）為研究對象，觀察iASCs分別與骨髓間充質干細胞(BMSCs)、臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)、胎盤間充質干細胞(PDMSCs)共同培養(yǎng)時，iASCs成骨能力的變化。初步探究體內MSCs對骨祖細胞分化的調節(jié)作用。
　　材料和方法：
　　1、ASCs提取無菌條件下吸取新鮮的人皮下吸脂術所得的脂肪組織20mL， PBS沖洗，向脂肪組織懸液中加入I型膠原

2、酶進行震蕩消化，通過貼壁法獲得原代ASCs。DMEM/F-12培養(yǎng)液中原代培養(yǎng)7天，每3天換液一次，融合度達到70％-80%時傳代，應用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，計數。
　　2、cck-8檢測ASCs、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs在0-7天時的增殖曲線。
　　3、實驗分組直接共培養(yǎng)組：取生長良好的第3代 ASCs，于成骨誘導培養(yǎng)液中進行7天誘導（iASCs）。經0.25%胰蛋白酶消化后，調整

3、 iASCs密度至2×104/ml。將 BMSCs、UC-MSCs和 PDMSCs，0.25%胰酶消化，調整各 MSCs密度至1×104/ml。將100μL iASCs分別與100μL的BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs混合加入96孔板，設實驗組，即為d-BMSCs組、d-UC-MSCs組和d-PDMSCs組，每組設6復孔。對照組為3×103個iASCs單獨接種于96孔板，所設復孔數如實驗組。在不同的時間間期，檢測各組細胞磷酸酶活

4、性和濃度。另設上述四組細胞，每組6孔，檢測不同時間間期各組細胞礦化基質形成情況。所有細胞在24h后更換為礦化培養(yǎng)液。
　　間接共培養(yǎng)組：生長良好的 iASCs經消化后，細胞密度如上組。將100μL iASCs含細胞2×103個加入96孔板中，分別用BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，設為實驗組，即為 ind-BMSCs組、ind-UC-MSCs組和ind-PDMSCs組，24h后各組更換為相對應的條件培養(yǎng)液。

5、對照組為2×103個iASCs培養(yǎng)于96孔板，為ind-iASCs。上述四組細胞，每組6孔，檢測各組細胞磷酸酶活性和濃度。另設上述四組細胞，每組6孔，檢測不同時間間期各組細胞礦化基質形成情況。
　　4、檢測分析將上述96孔板置于細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，分別于第3,5,7,10,12,14天的同一時間點，每組取6孔，利用堿性磷酸酶試劑盒操作要求測定四組細胞光密度（OD）值，計數其堿性磷酸酶濃度和活性。
　　分別于第7,10,12,1

6、4天的同一時間點，每組取6孔，利用茜素紅進行染色。同時利用茜素紅染料可溶于氯化十六烷基吡啶（cetylpyridinium chloride，CPC）溶液重新析出的特點，定量分析礦化基質形成情況。
　　實驗所得數據利用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異具有統計學意義。
　　結果：
　　1、對于提取的ASCs，細胞具有類似成纖維細胞的形態(tài)，具有典型的MSCs相關表面

7、分子，同時具有向中胚層組織分化的潛能。BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs與 ASCs具有相似的形態(tài)。通過繪制增殖曲線可知，增值能力UC-MSCs>PDMSCs>ASCs> BMSCs。
　　2、ALP表達情況，不同組織來源的MSCs表現有差別。在直接共培養(yǎng)時， BMSCs促進iASCs表達ALP的能力最強，其表達水平和活性均為最高，顯著高于其他兩種 MSCs。UC-MSCs組和 PDMSCs組表現相近。在間接共培養(yǎng)時， UC

8、-MSCs和PDMSCs條件培養(yǎng)液促進iASCs表達ALP的能力強于BMSCs。
　　3、礦化基質形成情況，不同組織來源的MSCs同樣表現不同。共培養(yǎng)時各實驗組均高于對照組。在直接共培養(yǎng)時，PDMSCs組在各時間點礦化基質形成最多，UC-MSCs組礦化基質形成多于 BMSCs組，但無統計學差異。在間接共培養(yǎng)組中，UC-MSCs條件培養(yǎng)液組礦化基質形成多于BMSCs和PDMSCs條件培養(yǎng)液組，PDMSCs條件培養(yǎng)液組多于BMSCs條

9、件培養(yǎng)液組。
　　結論：
　　1、采用膠原酶消化法獲得的皮下脂肪來源的ASCs具有MSCs的特征。
　　2、皮下脂肪來源的ASCs具有與BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs相似的細胞形態(tài)，生長方式和增殖特性。
　　3、ASCs經成骨誘導7天后獲得的iASCs具有與骨祖細胞（成骨細胞前體）相似的特征，可為骨組織工程研究提供充足的細胞來源。
　　4、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs均可促進iASCs

10、向成骨細胞分化。又有各自不同的特點：BMSCs可促進并維持iASCs高表達ALP，使iASCs處于成骨早期階段；UC-MSCs和 PDMSCs在促進 ALP表達方面能力弱于 BMSCs，但UC-MSCs和 PDMSCs可加快 iASCs向成骨細胞分化的速度，并可促進 iASCs分泌細胞外基質。
　　5、BMSCs、UC-MSCs和PDMSCs通過直接或間接接觸均可調節(jié)iASCs向成骨細胞分化，但其中直接接觸調節(jié)起主要作用，直接接觸