大豆異黃酮Genistein的腦缺血保護活性及以煙草作為生物反應器產(chǎn)生Genistein的初步研究.pdf

1、異黃酮Genistein是大豆中的一種次生代謝物，它可通過對動物及人體細胞和分子水平的多種調控機制，預防疾病發(fā)生，發(fā)揮健康效應。通過尋找植物異黃酮合成途徑中的關鍵酶基因，采用遺傳轉化的手段，增加非豆科植物中Genistein含量，可提供更廣泛的異黃酮來源，促進人體健康。本研究在整體動物和體外細胞模型中，較為系統(tǒng)地研究了Genistein腦缺血保護相關的藥理學活性，并闡明其保護作用的相關機理;通過調控異黃酮代謝途徑中的關鍵酶基因，以非豆科

2、植物煙草作為生物反應器，在煙草中表達影響Genistein合成的基因并觀察其積累。主要研究結果有以下幾點:
　　1.通過建立小鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)及再灌注模型，評價Genistein的抗腦缺血保護活性。Genistein（2.5，5，10 mg/kg）連續(xù)灌胃給予14 d可明顯降低腦缺血再灌注小鼠的腦梗塞率，提高神經(jīng)行為學評分，減少神經(jīng)細胞凋亡率。Genistein預處理可抑制缺血腦組織及線粒體中活性氧(ROS)的生成，增

3、加超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的活性，并降低丙二醛(MDA)含量，體現(xiàn)出良好的抗氧化作用。Genistein可改善缺血后的線粒體功能障礙，表現(xiàn)為阻止細胞色素C由線粒體釋放到細胞質，并抑制凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的活化。此外，Genistein可有效阻斷在缺血條件下ROS誘導的核因子-κB(NF-κB)信號轉導通路激活:通過下調NF-κB/p65的表達和磷酸化、阻止抑制蛋白κBa(IκBa)的降解及磷酸化，

4、對整個信號通路起抑制作用。以上結果表明，Genistein對于局灶性腦缺血小鼠的保護作用可能與直接和間接的抗細胞氧化、改善線粒體功能以及抑制NF-κB信號通路激活相關。
　　2.在外源性過氧化氫(H2O2)誘導的神經(jīng)元損傷模型中，通過形態(tài)學觀察、免疫細胞化學鑒定和western blot檢測，我們發(fā)現(xiàn)Genistein（0.01-1μM）預處理24 h可有效抵抗500μM H2O2介導的細胞存活率下降和ROS的過量積累。Genis

5、tein可顯著抑制神經(jīng)元凋亡，逆轉凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的比值，抑制caspase-9和caspase-3的活性。在體外實驗中，我們同樣觀察到Genistein可下調NF-κB/p65的表達，并抑制p65和IκBa磷酸化。此外，Genistein還能抑制氧化應激狀態(tài)下促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路的激活，包括c-Jun氨基末端激酶(JNK)和細胞外信號相關激酶(ERK)。這些結果表明，Genistein可通過減少細

6、胞內ROS生成、調節(jié)凋亡相關蛋白和抑制ROS誘導的NF-κB及MAPK信號通路激活，有效地對抗氧化應激損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　3.以兩種大豆材料北豐17(Beifeng17)和ZYD4368作為實驗材料，克隆了大豆異黃酮合酶IFS1和IFS2兩種亞型的cDNA序列。構建pMDC83-Beifeng17IFS1、pMDC83-ZYD4368IFS1、pMDC83-Beifeng17IFS2和pMDC83-ZYD4368IFS2

7、四種過表達載體，采用農(nóng)桿菌侵染的方法，遺傳轉化模式植物煙草。經(jīng)PCR鑒定，共獲得轉基因植株128株，總陽性率達87.1％。采用實時熒光定量PCR檢測轉基因煙草中目的基因的表達情況及拷貝數(shù)。結果顯示，葉片中IFS1基因表達量在6-50之間，含1-9個拷貝數(shù);IFS2基因表達量為2-25，含1-7個拷貝數(shù)。轉基因煙草花瓣中兩種基因的表達與葉片中相比無顯著差異。采用高效液相色譜(HPLC)方法檢測轉基因植抹中Genistein含量。在所有檢測

8、花瓣樣品中均觀察到Genistein積累，其中轉IFS1植株Genistein含量為5.41-6.28μg/g鮮重，轉IFS2植株Genistein含量達19.65-23.7μg/g鮮重。在葉片中，共檢測到6株轉基因煙草含Genistein。其中轉Beifeng17IFS22株(3.06μg/g鮮重和6.27μg/g鮮重)，轉ZYD4368IFS24株（3.31-18.78μg/g鮮重），而在兩種轉IFS1煙草葉片中未檢測到Genist

9、ein積累。在營養(yǎng)生長期間，野生型和轉基因煙草的表型無明顯差別。但在生殖生長時期，我們觀察到多株轉基因植株花色變淡的現(xiàn)象。以上結果表明，IFS2基因在Genistein合成途徑中發(fā)揮更為關鍵的作用，轉基因煙草花中Genistein含量及表達的穩(wěn)定性顯著高于葉片。進一步對影響Genistein合成的關鍵遺傳因素進行調控，增加其含量，作為可能的植物生物反應器應用于實際生產(chǎn)中。
　　綜上所述，大豆異黃酮Genistein具有良好的腦保護