肉蓯蓉苯乙醇總苷抗肝纖維化作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：體內(nèi)觀察肉蓯蓉苯乙醇總苷（CPhGs）對(duì)牛血清白蛋白（BSA）誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化大鼠的影響，分析血清學(xué)指標(biāo)、肝組織病理及免疫組化指標(biāo)，評(píng)價(jià)CPhGs抗肝纖維化的作用。體外觀察CPhGs對(duì)HSC的增殖和凋亡及對(duì)細(xì)胞活力的影響，從細(xì)胞學(xué)水平闡述CPhGs抗肝纖維化的作用；同時(shí)研究CPhGs對(duì)TGF-β1/smad和PDGF/ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，探討其抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)，從分子水平闡明其作用的分子機(jī)制，為其進(jìn)一步的新藥開(kāi)

2、發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　方法：⑴實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)雄性SD大鼠75只，分為6組，即正常對(duì)照組、肝纖維化模型組、復(fù)方鱉甲軟肝片陽(yáng)性對(duì)照組（BJRG,600 mg/kg）、CPhGs高劑量組（500 mg/kg）、中劑量組（250 mg/kg）、低劑量組（125 mg/kg），CPhGs高中低劑量組每組各13只，其余每組各12只。建立大鼠免疫性肝纖維化模型，造模同時(shí)給藥干預(yù)，除空白對(duì)照組和模型組灌胃給予蒸餾水外，其余各組均按設(shè)定劑量灌胃給

3、藥；造模結(jié)束后繼續(xù)治療4周，給藥結(jié)束后收集大鼠血清、肝、脾組織，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)大鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（GOT）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血清總膽紅素（TB）、血清直接膽紅素（DB）；放射免疫法檢測(cè)血清中透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）含量；ELISA測(cè)定血清TGF-β1水平；HE染色及Masson染色觀察肝臟病理組織學(xué)變化；免

4、疫組化法測(cè)定肝組織中TGF-β1、I型膠原、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)。⑵采用HSC分別以含CPhGs濃度為0，3.91，7.81，15.63，31.25，62.50，125.00，250.00，500.00μg/mL濃度的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)48 h。用四甲基偶氮唑鹽法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，測(cè)量CPhGs對(duì)HSC的半數(shù)抑制率（IC50）；選取CPhGs（25，50，100μg/mL）作用于HSC及正常肝細(xì)胞（HL7702），24h、48h、7

5、2h、96 h后MTT法檢測(cè)不同受試藥物對(duì)HSC及HL7702增殖的影響；LDH比色法測(cè)定藥物細(xì)胞毒性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)CPhGs（25，50，100μg/mL）對(duì)HSC凋亡的影響；進(jìn)一步RT-PCR法檢測(cè)CPhGs對(duì)HSC細(xì)胞α-SMA、Caspase3、NF-kB p65 mRNA表達(dá)，Western blot法檢測(cè)不同受試藥物對(duì)凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。⑶MTT觀察25，50，75，100μg/mL濃度的CPhGs在不同

6、時(shí)間對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC增殖的影響，采用RT-PCR法檢測(cè)25，50，75，100μg/mL濃度的CPhGs對(duì)smad2、smad3、smad7 mRNA的表達(dá)；采用Western blot法檢測(cè)25，50，75，100μg/mL濃度的CPhGs對(duì)TGF-β1/smad通路蛋白smad2，smad3，p-smad2，p-smad3和smad7的表達(dá)。MTT法觀察25，50，75，100μg/mL濃度的CPhGs在不同時(shí)間對(duì)血小板衍

7、生生長(zhǎng)因子（PDGF）誘導(dǎo)的HSC增殖的影響，采用RT-PCR法檢測(cè)25，50，75，100μg/mL濃度的CPhGs對(duì)α-SMA、I型膠原、ERK1/2、c-fos、c-jun mRNA的表達(dá)；采用Western blot法檢測(cè)25，50，75，100μg/mL濃度的CPhGs對(duì)PDGF/ERK1/2通路蛋白I型膠原、ERK1/2、p-ERK1/2表達(dá)的差異。
　　結(jié)果：①與模型組相比，CPhGs各劑量組肝纖維化大鼠的肝脾指數(shù)均

8、明顯降低（P＜0.05），血清肝功能酶中除低劑量組TB和DB外，CPhGs其余劑量組的GPT、GOT、ALP、TP、TB和DB含量明顯下降（P＜0.05），ALB含量明顯升高（P＜0.05）血清肝纖維化標(biāo)志HA、LN、PCIII、IV-C含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），肝組織HyP含量降低（P＜0.01），血清TGF-β1含量降低（P＜0.01），并且，CPhGs高劑量組的肝脾指數(shù)、血清學(xué)指標(biāo)、肝纖維化四項(xiàng)指標(biāo)、HyP含量

9、的效果與BJRG陽(yáng)性對(duì)照組接近；HE染色、Masson染色結(jié)果顯示CPhGs各劑量組肝纖維化程度減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，膠原纖維沉積明顯減少，假小葉形成減少，均顯著低于模型組（P＜0.01），CPhGs高、中劑量組肝纖維化程度與BJRG陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)，各劑量組肝組織中I型膠原、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)明顯受到抑制（P＜0.05或P＜0.01），I型、Ⅲ型膠原較模型組比較，僅見(jiàn)于中央靜脈周?chē)皡R管區(qū)，病理著色淺且少，呈現(xiàn)細(xì)絲狀纖維；TGF-β1

10、的表達(dá)顯示，細(xì)胞漿的棕黃色表達(dá)面積較模型組明顯縮小，染色以淺黃色為主（P＜0.01）。②CPhGs對(duì)HSC的增殖抑制率隨著藥物濃度的升高逐漸升高，IC50為119.125μg/mL；不同濃度的CPhGs對(duì)HL7702有輕度的增殖作用，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（25-100）μg/mL的CPhGs對(duì)HSC細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性作用（P＞0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，CPhGs100μg/mL濃度組的凋亡率最高，為20.8％，與空白對(duì)照組比較，

11、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，不同濃度的CPhGs均可抑制α-SMA、NF-kB p65 mRNA水平，促進(jìn)caspase3 mRNA水平，Western blot分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，不同濃度的CPhGs藥物組HSC Bcl-2/Bax均明顯降低（P＜0.05）。③（50-100）μg/mL的CPhGs可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC的增殖（P＜0.05）；（25-100）μg/

12、mL劑量組的CPhGs均可抑制smad2和smad3 mRNA和蛋白水平的表達(dá)，并且明顯抑制smad2和smad3蛋白的磷酸化水平，促進(jìn)smad7 mRNA和蛋白的表達(dá)。④（50-100）μg/mL的CPhGs可以抑制rrPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC的增殖（P＜0.05）；（25-100）μg/mL劑量組的CPhGs均可抑制α-SMA、I型膠原、ERK1/2、c-fos、c-jun mRNA水平，Western blot法檢測(cè)CPhGs可

13、明顯抑制I型膠原、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論：⑴CPhGs對(duì)BSA誘導(dǎo)的大鼠免疫性肝纖維化具有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低TGF-β1、I型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞活化、減少膠原生成有關(guān)。⑵CPhGs可明顯抑制HSC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡；對(duì)HL7702的生長(zhǎng)具有正向調(diào)節(jié)作用；其誘導(dǎo)HSC凋亡的機(jī)制可能與降低Bcl-2蛋白表達(dá)，增加bax蛋白表達(dá)及降低Bcl-2/Bax比值有關(guān)。⑶CPhG