細(xì)胞松弛素B及單軸拉伸應(yīng)力對山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞影響的體外研究.pdf

1、目的：
　　采用肌動蛋白抑制劑-細(xì)胞松弛素B（Cytochalasin B，CB）及單軸拉伸應(yīng)力作用于山羊顳下頜（Temporalmandibular joint，TMJ）關(guān)節(jié)盤細(xì)胞，觀察細(xì)胞骨架蛋白及細(xì)胞功能的變化，為組織工程化顳下頜關(guān)節(jié)盤的研究提供必要的研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、體外分離、培養(yǎng)及鑒定原代山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞，傳至P1代，液氮內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?br>　　2、檢測不同濃度的CB對TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞增殖能

2、力的影響，并篩選得到最適濃度，用于后期實驗。
　　3、觀察單軸循環(huán)拉伸應(yīng)力作用下TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞生長及形態(tài)的變化，確定合適的拉伸應(yīng)力參數(shù)。
　　4、免疫熒光染色檢測CB和單軸拉伸應(yīng)力作用后TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架的變化。
　　5、實時熒光定量PCR檢測CB和單軸拉伸力作用后TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞肌動蛋白、微管蛋白、波形蛋白、糖胺多糖及Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定：

3、
　　原代培養(yǎng)的山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞生長較慢，10天左右可貼壁生長至80％-90%，細(xì)胞從組織塊爬出生長；但隨傳代次數(shù)增加，細(xì)胞生長速度加快，約7天可進行下次傳代；細(xì)胞形態(tài)分為兩種，長梭形和多邊形，且數(shù)量上以長梭形為主；甲苯胺藍(lán)染色（糖胺多糖）及免疫組化染色（Ⅰ型膠原）均為陽性。
　　2、CB濃度篩選：
　　不同濃度的CB均對TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞增殖能力具有抑制作用，但2μmol/L組隨培養(yǎng)時間延長細(xì)胞的增殖能力逐漸恢復(fù)；

4、而≧4μmol/L各組細(xì)胞均未出現(xiàn)增殖，因此2μmol/L更適合后期實驗的研究。
　　3、拉伸應(yīng)力參數(shù)：
　　2%拉伸比（0.5Hz，1小時/天，連續(xù)3天）作用可促進TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞增殖及調(diào)整細(xì)胞生長方向，細(xì)胞的生長方向一致，且與力學(xué)加載方向垂直；而4%和8%拉伸比作用對TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞的生長具有抑制作用，隨拉伸應(yīng)力的作用時間延長細(xì)胞逐漸脫壁凋亡。
　　4、細(xì)胞形態(tài)及骨架的變化：
　　CB（2μmol/L）作用后

5、TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞突起結(jié)構(gòu)逐漸消失，細(xì)胞形態(tài)變圓，肌動蛋白纖維絲明顯的斷裂，熒光強度降低；
　　拉伸應(yīng)力（拉伸比為2%）可使TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞形態(tài)變得更狹長，肌動蛋白和微管蛋白纖維絲增粗，熒光染色強度增加，而波形蛋白纖維絲稀疏，熒光染色強度降低。
　　5、RT-PCR檢測：
　　CB（2μmol/L）作用后細(xì)胞的肌動蛋白和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)分別下降了57%、41%，糖胺聚糖mRNA表達(dá)上調(diào)了137%；
　　2%拉伸

6、應(yīng)力作用后細(xì)胞肌動蛋白、微管蛋白及糖胺聚糖mRNA的表達(dá)分別上調(diào)了90%、71%、83%，Ⅰ型膠原mRNA變化不明顯，而波形蛋白mRNA的表達(dá)下降了57%。
　　結(jié)論：
　　1、細(xì)胞松弛素B對山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞形態(tài)、表型及細(xì)胞基質(zhì)合成都具有明顯調(diào)控作用，抑制肌動蛋白的表達(dá)可能有利于自組裝的顳下頜關(guān)節(jié)盤的構(gòu)建。
　　2、TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞只能適應(yīng)低拉伸比的單軸拉伸應(yīng)力，且應(yīng)力作用下細(xì)胞的表型、生長方向、細(xì)胞骨架及胞外基質(zhì)