PFOS暴露對新生鼠海馬的損傷及外源性神經(jīng)干細胞移植的干預作用.pdf

1、全氟辛烷磺酸(Perfluorooetane sulfonate,PFOS)是廣泛存在的，化學性質(zhì)非常穩(wěn)定的環(huán)境污染物。PFOS被發(fā)現(xiàn)存在潛在的神經(jīng)毒性，尤其對于處在生長發(fā)育期的動物更為敏感。海馬是大腦參與學習、記憶過程中的重要結(jié)構(gòu)，海馬齒狀回的神經(jīng)干細胞是成年后能增殖、分化成神經(jīng)元的部位之一，其極易受外界環(huán)境因素的影響，導致神經(jīng)發(fā)生不足。近年來，對于PFOS引起的神經(jīng)毒性作用受到關(guān)注，但其損傷機制尚不清楚,更無有效的手段來修復其對中樞

2、神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。外源性神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)移植作為一種治療手段，能代替、修復中樞損傷的神經(jīng)元，為腦損傷修復帶來了希望。
　　目的：探討PFOS暴露對新生鼠海馬結(jié)構(gòu)和認知功能影響及可能的損害機制，同時探討外源性NSCs移植可能的干預作用。
　　方法：實驗一：將實驗動物隨機分為對照組和模型組，每組各35只。模型組給予PFOS10mg/kg·d腹腔注射染毒，對照組給予等量含2％Tween-80

3、的生理鹽水，共4周。記錄體重，并行水迷宮、曠場實驗、滾輪實驗以觀察神經(jīng)行為變化，確定造模成功。取海馬組織行HE染色，觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。實驗二：取新生一天SD幼鼠第三腦室室管膜區(qū)組織完成神經(jīng)干細胞培養(yǎng)及鑒定，經(jīng)枕大池行蛛網(wǎng)膜下腔神經(jīng)干細胞移植，將實驗動物分為：對照組（Con）、單純移植組(T)、移植干預組(P10+T)和模型組(P10)，分別在移植后1、2、4周記錄體重，同時行水迷宮、曠場實驗等觀察神經(jīng)行為變化，并在移植后第4周，取材采用

4、HE染色觀察NSCs移植對海馬組織形態(tài)的影響；采用Western blot和qRT-PCR技術(shù)檢測海馬α7nAChR蛋白和mRNA的表達水平；采用ELISA法觀察血清IL-1β；采用高效液相法測定海馬組織氨基酸水平。實驗三：將實驗動物分為對照組(Con，等量生理鹽水)，低劑量染毒組（P5，5mg/kg·d PFOS組），高劑量染毒組（P10，10mg/kg·d PFOS組），每組10只，染毒4周。4周后，采用Dot-blot技術(shù)，檢測炎

5、性因子CINC-3、CNTF、IL-1β、IL-6、TNF-α的變化；采用Western-blot和qRT-PCR檢測海馬組織表觀遺傳修飾相關(guān)調(diào)控酶Dmnt3a、EpC1、Suv420h2、Hdac8蛋白和mRNA表達水平。
　　結(jié)果：實驗一：1.PFOS暴露對一般情況的影響，模型組出現(xiàn)肛門周圍糞便沾染嚴重，活動減緩、少動呆臥、嗜睡、進食量減少及消瘦等神經(jīng)抑制癥狀，同時，模型組與對照組比較，幼鼠體重增長減緩（P<0.05）；2.P

6、FOS暴露對神經(jīng)行為的影響，結(jié)果顯示：水迷宮實驗學習的第2天，模型組的逃逸潛伏期即長于對照組（P<0.05），并隨暴露時間顯著性差異更加明顯（P<0.01），在第5天撤去平臺測試時，模型組目標象限停留時間和跨臺次數(shù)均少于對照組（P<0.05、P<0.01）；曠場實驗中，與對照組比較，模型組的中央格停留時間長（P<0.01）、站立次數(shù)少（P<0.01）、總距離短（P<0.01）；滾輪實驗中，模型組在轉(zhuǎn)桿上持續(xù)的時間與對照組比較無顯著性差異

7、（P>0.05）；3.PFOS暴露對海馬組織形態(tài)的影響，模型組海馬神經(jīng)元排列紊亂、輪廓模糊、核固縮，并且海馬CA1區(qū)和齒狀回閂區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量也明顯少于對照組。實驗二：1.外源性NSCs移植對一般情況的影響，結(jié)果顯示：與P10組比較，P10+T組在移植后4周時精神逐漸好轉(zhuǎn)、活動增加，但體重仍無顯著性差異（P﹥0.05）；2.外源性NSCs移植對神經(jīng)行為學的影響，結(jié)果顯示：移植后4周，與P10組比較，P10+T組目標象限停留時間延長（P﹤0

8、.05）、中央格停留時間明顯縮短（P﹤0.01）、站立次數(shù)增多（P﹤0.05），行走總距離增長（P﹤0.05）；3.外源性NSCs移植對海馬組織形態(tài)的影響，結(jié)果顯示：P10+T組與P10組比較，神經(jīng)元排列趨于整齊、密度增高、細胞形態(tài)有所恢復；4.外源NSCs移植對大鼠海馬炎性因子IL-1的影響，與Con組比較，P10組血清中IL-1β明顯升高(P﹤0.001)；P10+T組的IL-1β水平與P10組比較顯著下降(P﹤0.001)；5.外

9、源性NSCs移植對海馬α7nAChR的影響，結(jié)果顯示：與Con組比較，P10組α7nAChR蛋白和mRNA表達水平明顯降低(均為P<0.001)；與P10組比較，P10+T組海馬區(qū)α7nAChR蛋白和mRNA表達水平均明顯升高(均為P<0.001)；6.外源性NSCs移植對海馬組織氨基酸水平的影響，結(jié)果顯示：與Con組比較，P10組谷氨酸含量明顯降低（P﹤0.05）；而與P10組比較，P10+T組谷氨酸含量明顯升高（P﹤0.05）。實驗

10、三：1.PFOS早期暴露對海馬組織炎性因子的影響，與Con組比較，P5組和P10組的CINC-3、CNTF、IL-1b、IL-6、TNF-a等炎性因子水平均明顯升高。與P5組比較，P10組海馬CINC-3、CNTF、TNF-a的表達水平均明顯升高（P<0.05）；2.PFOS早期暴露對海馬組織表觀遺傳修飾相關(guān)調(diào)控酶的影響，Western blot檢測Dmnt3a、EpC1、Suv420h2、Hdac8蛋白表達水平，結(jié)果顯示，與Con組比

11、較，P5和P10組Dmnt3a均明顯增高（P<0.01），而EpC1、Suv420h2、Hdac8蛋白表達水平，P5組明顯降低（P<0.05、P<0.001、P<0.001），P10組也明顯降低（P<0.01、P<0.001、P<0.001）。同時，與P5組比較，P10組Dmnt3a明顯增高（P<0.05），而EpC1、Suv420h2、Hdac8蛋白表達水平明顯降低（P<0.01）。采用qRT-PCR進一步觀察Dmnt3a、EpC1、

12、Suv420h2、Hdac8mRNA水平的變化，與Con組比較，P5組Dmnt3a mRNA表達水平無明顯差異（P﹥0.05），而EpC1、Suv420h2、Hdac8mRNA表達水平明顯降低（P<0.01、P<0.001、P<0.001）。同時，P10組Dmnt3a mRNA表達水平顯著增高（P<0.001），而EpC1、Suv420h2、Hdac8mRNA表達水平均降低(均為P<0.001)。但P10組與P5組比較，以上mRNA表達