銀、銅離子對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制探索.pdf

1、典型的傷口愈合過(guò)程包括炎癥期、血管生成和肉芽組織形成期、再上皮化和結(jié)締組織重構(gòu)等階段，其中角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖及上皮化是傷口封閉的中心環(huán)節(jié)。圍繞促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖這一關(guān)鍵點(diǎn)，衍生出了各式各樣的局部治療技術(shù)及藥物。銀、銅、鋅等金屬制劑及敷料長(zhǎng)期以來(lái)在燒傷創(chuàng)面的局部治療中發(fā)揮著重要作用。為深入探究它們的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，我們以硝酸銀、硝酸銅對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響為例，開展了相關(guān)的研究工作。
　　大量的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ag+及Cu2+在≥

2、1×10-4 M濃度下均存在不同程度的細(xì)胞增殖毒性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也報(bào)道了高濃度含銀制劑及敷料對(duì)創(chuàng)面愈合的負(fù)面影響。然而，在亞細(xì)胞毒濃度下，Ag+、Cu2+對(duì)細(xì)胞雖無(wú)增殖毒性，但細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生卻明顯增加。這部分增加的細(xì)胞內(nèi)活性氧所產(chǎn)生的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)尚不明確。眾所周知，ROS除了參與細(xì)胞凋亡、壞死，還可作為重要的信號(hào)分子，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄因子激活，從而影響基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。據(jù)此，我們通過(guò)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，亞細(xì)

3、胞毒濃度的Ag+、Cu2+能夠在特定的濃度范圍內(nèi)既促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，又同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。
　　綜上所述，我們假設(shè)不同濃度的Ag+、Cu2+對(duì)誘導(dǎo)人角質(zhì)形成細(xì)胞ROS產(chǎn)生具有不同的影響，這也進(jìn)一步向下游傳導(dǎo)影響人角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活性，且Ag+、Cu2+在ROS產(chǎn)生的雙向性劑量-效應(yīng)關(guān)系上相互契合。本研究以不同濃度Ag+、Cu2+對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系（HaCaT細(xì)胞）增殖功能的影響為觀察重點(diǎn)，運(yùn)用活性氧清除劑NAC

4、尋找并驗(yàn)證其與細(xì)胞內(nèi)ROS生成上調(diào)的相互關(guān)系。同時(shí)，運(yùn)用iTRAQ技術(shù)尋找組間差異蛋白，進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)分析其功能富集情況，預(yù)期初步明確Ag+、Cu2+作用下角質(zhì)形成細(xì)胞增殖相關(guān)的潛在分子靶點(diǎn)。
　　1.研究目的：
　　本研究擬觀察不同濃度Ag+、Cu2+對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能影響，檢測(cè)其誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生能力，采用活性氧清除劑驗(yàn)證ROS在亞細(xì)胞毒濃度Ag+、Cu2+促增殖效應(yīng)中扮演的角色，利用高通量的iTRAQ技術(shù)

5、篩選差異蛋白并做功能注釋和富集分析，尋找細(xì)胞增殖及ROS生成相關(guān)的潛在分子靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究Ag+、Cu2+影響角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2.研究方法
　　2.1 Ag+對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能及細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響
　　2.1.1 采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度Ag+和（或）活性氧清除劑(NAC)對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能的影響，鑒別Ag+的細(xì)胞毒性濃度與亞細(xì)胞毒濃度;對(duì)特定的亞細(xì)胞濃度進(jìn)行Br

6、dU摻入、PCNA表達(dá)、細(xì)胞周期等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，以驗(yàn)證細(xì)胞增殖活性改變。
　　2.1.2 通過(guò)DCFH-DA熒光分析檢測(cè)不同濃度Ag+和（或）NAC對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平的影響。
　　2.1.3 應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)定量技術(shù)篩選亞細(xì)胞毒濃度Ag+作用下人角質(zhì)形成細(xì)胞的差異蛋白，并對(duì)所有差異蛋白質(zhì)做功能注釋和富集分析。
　　2.2 Cu2+對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響
　　2.2.1

7、采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度Cu2+和（或）NAC對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能的影響。
　　2.2.2 通過(guò)DCFH-DA熒光分析檢測(cè)不同濃度Cu2+和（或）NAC對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生水平的影響。
　　2.2.3 應(yīng)用iTRAQ蛋白質(zhì)定量技術(shù)篩選亞細(xì)胞毒濃度Cu2+作用下人角質(zhì)形成細(xì)胞的差異蛋白，并對(duì)所有差異蛋白質(zhì)做功能注釋和富集分析。
　　2.2.4 采用雄性BALB/c小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型評(píng)價(jià)不同濃度Cu2

8、+對(duì)創(chuàng)面愈合的影響。
　　3.研究結(jié)果：
　　3.1 Ag+對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖功能及細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響
　　3.1.1 10-6M、10-5M Ag+在24 h、48 h和72 h均能明顯促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，細(xì)胞相對(duì)增殖率約103.18％～118.76％(P值均＜0.05)，在24 h～120 h的各個(gè)時(shí)相點(diǎn)上，10-8M、10-7 M Ag+對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響，細(xì)胞相對(duì)增增殖率約99.24％～1

9、04.65％(P值均＞0.05)，而10-4 M Ag+造成細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)完全死亡，OD值波動(dòng)在0.263～0.283，接近于空白值;10-6M、10-5M Ag+作用HaCaT細(xì)胞48 h后BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，PCNA免疫熒光增強(qiáng)，10-5M Ag+還顯著升高細(xì)胞的增殖指數(shù)(PI)。
　　3.1.2 10-6M、10-5M Ag+處理HaCaT細(xì)胞后，在5 min～60 min時(shí)間點(diǎn)上細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生顯著增強(qiáng);加入5 mM

10、NAC共培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯減少;加入5mMNAC共培養(yǎng)后，10-6M、10-5M Ag+的促增殖效應(yīng)消失。
　　3.1.3 在10-6～10-4 M范圍內(nèi)進(jìn)一步細(xì)分篩選發(fā)現(xiàn)7.5×10-6 M濃度下Ag+具有最佳的促增殖作用;對(duì)0M、1×10-7M、7.5×10-6M濃度Ag+處理48 h的HaCaT細(xì)胞樣品進(jìn)行iTRAQ蛋白定量，通過(guò)對(duì)組間差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):7.5×10-6 MAg+組和1×10-7M A

11、g+組除在多樣化微生物代謝、氨酰基tRNA合成等通路富集外，在核糖體通路的差異蛋白富集率達(dá)15.15％(40/264)、16.58％(33/199)，且全部為上調(diào);在糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑、次生代謝物生物合成、乙醛酸和二元羧酸等眾多碳水化合物代謝相關(guān)的通路均有顯著富集。此外，7.5×10-6M Ag+組在RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用及半胱氨酸和蛋氨酸代謝等通路上具有自身獨(dú)特的富集表現(xiàn)。
　　3.2 Cu2+

12、對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖及小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響
　　3.2.1 與陰性對(duì)照(0 M Cu2+)相比，10-6、10-5M Cu2+處理48 h后HaCaT細(xì)胞相對(duì)增殖率分別顯著升高至116.19％(P=0.027)、113.37％(P=0.036)，5 mM NAC能拮抗其促增殖作用。10-4 M Cu2+組表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，相對(duì)增殖率下降至12.20％(P=0.001);進(jìn)一步上升至10-3 M時(shí)，細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)幾乎完

13、全死亡，OD值僅為（0.05±0.21，P＜0.01），基本接近于空白值。
　　3.2.2 與陰性對(duì)照(0 M Cu2+)相比，10-6、10-5、10-4 M組Cu2+處理HaCaT細(xì)胞30 min后其細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生達(dá)到127.47％（P=0.001）、124.28％(P=0.031)、125.60％(P=0.004)，60 min后進(jìn)一步上升至140.47％(P=0.002)、134.29％(P=0.007)、130.66％

14、(P=0.007);10-8、10-7 M Cu2+在處理后60 min也刺激HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯升高至110.99％（P=0.016）及117.34％(P=0.016);加入5 mM NAC共培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯減少。
　　3.2.3 對(duì)0M、1×10-7 M、1×10-6 M濃度Cu2+處理48 h的HaCaT細(xì)胞樣品進(jìn)行iTRAQ蛋白定量，通過(guò)對(duì)組間差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):1×10-7 M Cu2+

15、組和1×10-6M Cu2+組在糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑、丙酮酸代謝、脂肪酸代謝等通路顯著富集，其中在核糖體通路的差異蛋白富集率達(dá)12.07％和26.24％，且全部為上調(diào);此外，1×10-6 M Cu2+組在谷胱甘肽代謝及半胱氨酸、蛋氨酸代謝途徑上，差異蛋白上調(diào)率高達(dá)88.89％(8/9)，但兩條通路上富集的差異蛋白數(shù)合計(jì)僅占總差異蛋白數(shù)的2.36％(9/381)。
　　3.2.4 與陰性對(duì)照(0 M Cu2+)相

16、比，10-6M Cu2+水凝膠敷料在第6、8、10d能夠顯著提高小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合率;10-8M Cu2+組在第8、10d創(chuàng)面愈合率也顯著升高;10-4M Cu2+組的創(chuàng)面愈合率在第2～12 d各個(gè)時(shí)相點(diǎn)上與對(duì)照組無(wú)明顯差異，但其在第8、10d與10-6M Cu2+組之間存在明顯差異。
　　4.結(jié)論：
　　4.1 ≥1×10-4M的Ag+、Cu2+對(duì)HaCaT細(xì)胞均存在不同程度的細(xì)胞毒性。
　　4.210-6～1

17、0-5 M的Ag+、Cu2+均能在作用48 h后促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，濃度為7.5×10-6M Ag+，1×10-6M Cu2+具有最佳的促增殖作用。
　　4.3 在亞細(xì)胞濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生隨Ag+、Cu2+濃度增加而增加;活性氧清除劑NAC能夠降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，同時(shí)拮抗亞細(xì)胞毒濃度Ag+、Cu2+的促增殖效應(yīng)，且ROS變化水平與細(xì)胞相對(duì)增殖率呈正相關(guān)。
　　4.4 蛋白組學(xué)分析顯示:(1)亞細(xì)胞毒濃度Ag+

18、處理后可能引起HaCaT細(xì)胞碳水化合物代謝及蛋白質(zhì)合成增加，可能經(jīng)生物氧化過(guò)程增加ATP和ROS生成，進(jìn)一步由ROS激活下游的ERK1/2、JNK等通路，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖;(2)亞細(xì)胞毒濃度Cu2+處理HaCaT細(xì)胞后，在糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑、丙酮酸代謝、脂肪酸代謝等眾多能量代謝相關(guān)的通路均有顯著富集，在核糖體通路的差異蛋白富集率更達(dá)到12.07％和26.24％，且全部為上調(diào)，可能伴隨蛋白質(zhì)翻譯合成的