姬松茸多糖的提取純化及注射液的研制.pdf

1、姬松茸(Agaricus blazei Murill，ABM)是近年來新興的一種食藥兼用菌，因其富含多種活性成份，可作為免疫調(diào)節(jié)劑、抗癌劑、抗突變劑和抗菌物質(zhì)的來源，因而引起全世界的極大關(guān)注。由于姬松茸具有多種生物活性，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和前景，因而對其活性成分的提取分離就顯得尤為重要。對于姬松茸多糖的提取分離純化過程國內(nèi)外有很多報(bào)道，技術(shù)比較成熟，但是以姬松茸多糖為主原料的保健食品或抗癌藥物目前還少有報(bào)道。本論文以姬松茸粗多糖為原料，

2、開發(fā)姬松茸多糖注射液，為其作為一種新型的抗癌輔助藥物走向市場奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 為保證姬松茸多糖注射液的安全性，根據(jù)《中華人民共和國藥典》及《中藥、天然藥物提取純化工藝的相關(guān)規(guī)定》，選取了經(jīng)濟(jì)、安全、高效的分離、純化、濃縮和干燥方法。首先Sevage法除蛋白，根據(jù)文獻(xiàn)，確定氯仿：正丁醇為3:1，多糖濃度2mg·mL<'-1>時(shí)，重復(fù)三次，除蛋白效果最佳；脫色采用了雙氧水氧化法，為加快脫色時(shí)間，又要避免雙氧水對多糖結(jié)構(gòu)的破壞，實(shí)驗(yàn)在

3、37℃下進(jìn)行；透析、濃縮、干燥過程同樣為了保證多糖結(jié)構(gòu)的完整性和提取后物質(zhì)疏松易溶解，先透析，然后60℃濃縮，最后是冷凍干燥。此時(shí)得到的多糖半純品(AB)呈褐色，粉末狀，經(jīng)苯酚硫酸法和考馬斯亮藍(lán)G250法測得總糖含量和蛋白質(zhì)含量分別為85.4％和14.2％。多糖半純品通過DEAE-纖維素離子交換層析進(jìn)行初步分級(jí)純化，用0、0.1、0.3mol·L<'-1>的NaCl洗脫，得到三個(gè)組分，分別是AB-Ⅰ、AB-Ⅱ和AB-Ⅲ，其中AB-Ⅰ為中

4、性多糖，AB-Ⅱ和AB-Ⅲ為酸性多糖。AB-Ⅰ、AB-Ⅱ和AB-Ⅲ分別再通過Sepharose CL-4B凝膠層析進(jìn)一步分級(jí)，AB-Ⅰ得到單一對稱峰，透析干燥后為淡黃色粉末，AB-Ⅱ和 AB-Ⅲ在主峰之前分別有一小峰，收集主峰，得到AB-Ⅱ-b和AB-Ⅲ-b，透析干燥后分別呈黃色和褐色粉末。AB-Ⅰ、AB-Ⅱ-b和AB-Ⅲ-b經(jīng)純度鑒定后，表明為均一的多糖，總糖含量為91.8％、90.4％和89.2％，蛋白質(zhì)含量為7.1％、8.8％和9

5、.3％。 為了進(jìn)一步探討分離純化的多糖半純品AB及其組分AB-Ⅰ、AB-Ⅱ-b和AB-Ⅲ-b的免疫藥理作用，我們使用環(huán)磷酰胺建立了小鼠免疫低下模型，并對多糖處理前后小鼠的免疫功能變化情況進(jìn)行了檢測，如免疫器官重量試驗(yàn)、外周血血象測定、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)、溶血素生成試驗(yàn)、E玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，從非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫方面全面檢測它們的免疫藥理作用。結(jié)果表明環(huán)磷酰胺致小鼠免疫低下模型建立成功，四個(gè)多糖均

6、能弱化環(huán)磷酰胺對機(jī)體的毒副作用，并且有的指標(biāo)能達(dá)到空白對照組水平，正常小鼠經(jīng)四個(gè)多糖免疫后，與空白對照組相比除淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)外，均為差異極顯著(P<0.01)；在淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，AB-Ⅲ-b與空白對照組、AB和AB-Ⅰ組比較差異顯著(P<0.05)，AB、AB-Ⅰ和AB-Ⅱ-b組與空白對照組比較差異不顯著(P>0.05)。AB-Ⅲ-b在免疫器官重量試驗(yàn)和溶血素生成試驗(yàn)中，同.AB、AB-Ⅰ和AB-Ⅱ-b組比較也是差異極顯著(P<0

7、.01)，說明AB-Ⅲ-b具有較好的提高機(jī)體免疫力的作用。在上述研究的基礎(chǔ)上對姬松茸多糖注射液的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了設(shè)計(jì)，初步制得注射液成品，根據(jù)《中華人民共和國藥典》和《中藥、天然藥物相關(guān)的技術(shù)指導(dǎo)原則》對注射液的中間體進(jìn)行質(zhì)量安全性試驗(yàn)：急性毒性試驗(yàn)、肌肉局部刺激試驗(yàn)、過敏試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果均符合相關(guān)規(guī)定，表明姬松茸多糖注射液可以用于肌肉注射和靜脈注射，無毒副作用，不會(huì)產(chǎn)生不良后果。 綜上所述，姬松茸多糖是一種良好的免疫增