基于添加劑的氯過氧化物酶穩(wěn)定化及失活和激活機(jī)理研究.pdf

1、氯過氧化物酶(Chloroperoxidase，CPO)因其獨(dú)特的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)而具有鹵化、醇氧化、羥基化、環(huán)氧化、磺化氧化等多種多樣的催化活性，并且對底物具有手性識別功能和廣泛的底物適應(yīng)性，因此在現(xiàn)代合成化學(xué)、醫(yī)藥工業(yè)和環(huán)境生物催化中具有很大的應(yīng)用潛力。但在合成反應(yīng)體系中，常使用酸、堿和有機(jī)溶劑，反應(yīng)溫度也較高，在這樣的極端條件下，CPO易變性失活，使其實(shí)際應(yīng)用受到很大限制。所以研究基于特定底物對CPO失活和激活的機(jī)理，以研究提高極端條

2、件下CPO穩(wěn)定性的途徑，建立CPO的穩(wěn)定化平臺(tái)，這是開發(fā)其應(yīng)用潛能的前提。 本文采用非共價(jià)修飾—添加劑法，以CPO催化氧化吲哚生成氧化吲哚為模型反應(yīng)，研究了在各種溫度下，葡萄糖、果糖、樹膠醛糖、半乳糖、海藻糖、葡聚糖、木糖、聚乙二醇200(PEG200)、二-2(-乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉(AOT)等添加劑對CPO的穩(wěn)定性和活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在25℃時(shí)，表面活性劑AOT能使CPO的活性提高25％，在觀察的882 h內(nèi)保持不變

3、，而且能有效增加有機(jī)底物的溶解度；PEG200和甘油在25℃-60℃溫度范圍內(nèi)是有效的添加劑，特別是在50℃時(shí)，它們能把CPO的穩(wěn)定性從10 h延長到200 h以上。在40℃，50℃，60℃海藻糖存在時(shí)，CPO的穩(wěn)定性也分別被延長了2.6，7，2.5倍。文中對這幾種添加劑的保護(hù)機(jī)理進(jìn)行了初步討論。 本文還進(jìn)一步研究了葡萄糖導(dǎo)致的CPO失活。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在葡萄糖存在時(shí)，棕紅色的CPO能快速的轉(zhuǎn)化為綠色，同時(shí)CPO在398nm處的特征

4、吸收峰逐漸消失，而且這種綠色CPO非常穩(wěn)定。葡萄糖致使CPO失活的現(xiàn)象為首次報(bào)道。因此本文采用紫外可見吸收光譜、熒光光譜和激光拉曼光譜等譜學(xué)方法進(jìn)一步研究了葡萄糖與氯過氧化物酶(CPO)的相互作用，并和肌紅蛋白(Mb)、辣根過氧化物酶(HRP)、細(xì)胞色素P450等血紅素過氧化物酶及氯化血紅素與葡萄糖的相互作用進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在葡萄糖存在時(shí)只有CPO活性降低甚至完全喪失。本文基于實(shí)驗(yàn)事實(shí)對葡萄糖導(dǎo)致CPO失活的機(jī)理進(jìn)行了推測：由于血紅素

5、鐵第六配位點(diǎn)可接納其他功能配體，葡萄糖進(jìn)入CPO的活性中心后，其羥基氧作為電子給體和CPO活性中心的卟啉鐵發(fā)生部分配位，使卟啉環(huán)的結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲，非平面性增加，從而導(dǎo)致CPO失活。這可能由兩個(gè)原因?qū)е拢?1)CPO的活性位點(diǎn)更向卟啉環(huán)開放。CPO的遠(yuǎn)端酸堿催化成分是親水性的谷氨酸，而P450等其它血紅素過氧化物酶的相應(yīng)部位是疏水性的組氨酸。谷氨酸的堿性強(qiáng)于組氨酸，有利于增強(qiáng)葡萄糖上-OH的電子云密度，強(qiáng)化其給電子效應(yīng)，因而有利于葡萄糖和C

6、PO活性中心卟啉環(huán)上的鐵發(fā)生配位。(2)CPO晶體結(jié)構(gòu)研究顯示在CPO活性中心卟啉環(huán)的上方存在一個(gè)通道，底物可以利用這個(gè)通道接近活性中心，這個(gè)通道是可調(diào)節(jié)的，具有立體選擇性。葡萄糖與半乳糖相比其構(gòu)象不同：半乳糖的四個(gè)-OH為1a2a3a4a，而葡萄糖是1a2a3a4e；同時(shí)與六元醛糖的葡萄糖相比，木糖是五元酮糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葡萄糖與通道的立體選擇性最為匹配，因此葡萄糖使CPO失活的現(xiàn)象最顯著。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)SHCH<,2>COOH的加入