RACK1在肝細(xì)胞自噬中的作用和潛在的分子機(jī)制.pdf

1、背景：復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)在細(xì)胞生長、衰老、死亡等多種生命活動(dòng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，這些信號網(wǎng)絡(luò)的形成是由具有一定特異性的相對少量的信號分子(即支架蛋白)來完成的。激活的蛋白激酶C受體1（RACK1，基因名Gnb2l1）就是這樣的一種支架蛋白。RACK1分子量為36kDa，含有7個(gè)WD40重復(fù)序列，與G蛋白β亞基具有高同源性，在信號傳導(dǎo)過程中可以作為錨定蛋白和穿梭蛋白以參與信號的傳導(dǎo)或活化。大量研究表明RACK1在肝細(xì)胞癌等腫瘤的惡性生長中有

2、著重要促進(jìn)作用。而且RACK1在肝組織中高水平表達(dá)，但其在肝臟中的病理生理作用還是未知的。自噬是一個(gè)高度保守的細(xì)胞固有的生命進(jìn)程，這個(gè)過程中，細(xì)胞的一些多余的成分或衰老的器官被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體降解或者分解。以此作為機(jī)體重要的降解去路而存在。在肝臟中，自噬促進(jìn)脂肪降解，有利于脂代謝穩(wěn)態(tài)的維持。自噬的啟動(dòng)自噬的啟動(dòng)需要AMPK活化或mTOR活性受抑導(dǎo)致的ULK1活化，接著ULK1磷酸化Beclin1導(dǎo)致自噬起始復(fù)合體ATG14L-Beclin1

3、-VPS34-VPS15形成，MAPK家族成員JNK對Bcl2的磷酸化促使Bcl2與Beclin1解離，也有利于自噬起始復(fù)合體形成。Class III PI3K VPS34(也稱為PIK3C3)激酶活性在復(fù)合物形成后升高，催化磷脂酰肌醇(PI3P)生成，招募DFCP1形成Omega小體，進(jìn)而ATG12-ATG5共價(jià)結(jié)合，促進(jìn)膜延伸和閉合，誘導(dǎo)LC3B從胞漿型（LC3B I）轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば停↙C3B II）、促進(jìn)自噬體的形成。但是自噬起始復(fù)合

4、體的形成機(jī)制還不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)，RACK1對自噬有促進(jìn)性作用，并且參與自噬起始復(fù)合體的形成，RACK1缺失導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪堆積。這將為自噬的相關(guān)機(jī)制的研究和脂肪肝的治療方面的探索提供一些依據(jù)。
　　目的：在肝來源細(xì)胞中探索RACK1對自噬是否有影響；探討RACK1預(yù)防肝細(xì)胞脂肪堆積的作用；分析RACK1影響自噬的分子機(jī)制。
　　方法：以饑餓或mTOR抑制因子處理誘導(dǎo)自噬，以氯喹阻斷溶酶體活性；在上述處理前后通過Weste

5、rn Blot檢測自噬相關(guān)指標(biāo)LC3B II和ATG12-ATG5等的表達(dá)；透射電鏡觀察饑餓誘導(dǎo)自噬小體和脂肪滴的形成；Nile red染色分析脂肪堆積；免疫熒光分析DFCP1 Opuncta的形成；激酶活性分析的方法檢測VPS34活性；免疫沉淀與銀染、質(zhì)譜鑒定相結(jié)合尋找RACK1相互作用蛋白；利用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證RACK1和自噬起始復(fù)合體ATG14L-Beclin1-VPS34-VPS15之間的相互作用；利用GST-pull do

6、wn的方法檢測體外翻譯的自噬起始復(fù)合體成分和RACK1的直接結(jié)合。
　　結(jié)果：⑴在肝來源細(xì)胞系中敲低內(nèi)源RACK1的表達(dá)，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B II的本底水平和饑餓誘導(dǎo)的LC3B II生成顯著降低。RACK1敲低的情況下，mTOR抑制因子和/或氯喹作用后的LC3B II水平也降低，說明LC3B II水平下降的原因是自噬減少而不是溶酶體活性過強(qiáng)。Western Blot鑒定Gnb2l1F/F;Alb-Cre(即Gnb2l1?hep)小

7、鼠表明，RACK1在肝細(xì)胞中的表達(dá)缺失，但在其它組織中的表達(dá)與對照Gnb2l1F/F小鼠無差異。Gnb2l1?hep小鼠從生后4個(gè)月起肝臟變大、變黃；透射電鏡下可見6周大Gnb2l1?hep小鼠的肝細(xì)胞脂肪滴增多而糖原減少、線粒體數(shù)量增多但體積變??；饑餓48小時(shí)后，Gnb2l1F/F小鼠肝細(xì)胞中出現(xiàn)較多自噬小體，而Gnb2l1?hep小鼠的肝細(xì)胞無自噬小體，并且線粒體膨脹、脂肪滴數(shù)量和體積增大。Nile Red染色證實(shí)了脂肪的堆積。We

8、stern Blot表明饑餓前后Gnb2l1?hep小鼠肝組織LC3B II生成均減少,證實(shí)RACK1的缺失導(dǎo)致自噬水平的降低。⑵LC3B II的生成依賴于ATG12-ATG5的共價(jià)結(jié)合，Western Blot表明饑餓前后Gnb2l1?hep小鼠肝組織ATG12-ATG5生成均減少,提示RACK1影響更早期的分子事件。在RACK1敲低的肝來源細(xì)胞及其對照細(xì)胞中表達(dá)GFP-DFCP1，發(fā)現(xiàn)RACK1敲低導(dǎo)致DFCP1 Opuncta形成

9、的減少；并且整體VPS34激酶活性或ATG14L相關(guān)的VPS34激酶活性均在RACK1敲低或敲除的情況下降低，表明RACK1參與自噬的早期進(jìn)程。⑶為了進(jìn)一步揭示RACK1參與自噬的分子機(jī)制，我們在RACK1敲低的人肝來源細(xì)胞中表達(dá)GFP標(biāo)簽的人源RACK1分子，由于GFP-RACK1也受RNA干擾作用的影響，表達(dá)量很低，可以作為內(nèi)源RACK1分子發(fā)揮作用。免疫沉淀饑餓前后肝來源細(xì)胞中的“內(nèi)源樣”GFP-RACK1分子，經(jīng)銀染和質(zhì)譜鑒定，

10、發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能的RACK1結(jié)合蛋白VPS15，提示RACK1是自噬起始復(fù)合體的一個(gè)成分。免疫共沉淀證實(shí)了這一推測Gnb2l1?hep小鼠肝組織中，自噬起始復(fù)合體的形成顯著減少，說明RACK1促進(jìn)自噬起始復(fù)合體的形成。⑷在肝來源的細(xì)胞中表達(dá)外源的Flag-RACK1和GFP-RACK1，anti-FLAG免疫沉淀物中可以同時(shí)檢測到兩種不同標(biāo)簽的RACK1的存在，并且在饑餓處理后1h時(shí)，F(xiàn)LAG-RACK1共結(jié)合的GFP-RACK1量升高最

11、為明顯。GST-RACK1分別和體外翻譯的VPS15、VPS34、ATG14L、Beclin1進(jìn)行GST-pull down分析，復(fù)合物中可以檢測到VPS15、ATG14L、Beclin1的存在，表明RACK1直接與ATG14L, Beclin1和VPS15結(jié)合。⑸Western Blot表明饑餓前后Gnb2l1?hep小鼠肝組織P-JNK, P-AMPK, P-Ulk1無缺陷。
　　結(jié)論：肝細(xì)胞中，RACK1能夠穩(wěn)定自噬早期復(fù)合