聚β-羥基丁酸酯解聚酶發(fā)酵及酶性質(zhì)研究.pdf

1、聚β-基丁酸酯(PHB)為微生物在不平衡生長(zhǎng)條件下于細(xì)胞內(nèi)合成的一類貯藏性聚酯，廣泛存在于自然界原核生物中。因其不僅具有與化學(xué)合成高分子相似的性質(zhì)，而且，其良好的生物相容性、生物降解性、光學(xué)活性和壓電性等獨(dú)特的性質(zhì)使得PHB可以作為包裝材料、光學(xué)材料和醫(yī)用材料等取代通用的塑料而得到多方面的應(yīng)用。 本實(shí)驗(yàn)是在對(duì)PHB解聚酶降解行為充分研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)和分離純化途徑，對(duì)Penicilliumsp.DS9713a菌株產(chǎn)生的胞

2、外聚β-羥基丁酸酯(PHB)解聚酶進(jìn)行提純，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)及蛋白質(zhì)學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、以青霉(Penicilliumsp.)，編號(hào)DS9713a為實(shí)驗(yàn)菌株，采用傳統(tǒng)搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)胞外PHB解聚酶。產(chǎn)酶高峰分別出現(xiàn)在96h和72h。對(duì)發(fā)酵液按以下流程進(jìn)行分離純化：發(fā)酵液處理--->超濾濃縮(截留分子量5000)--->(NH4)2SO4沉淀除雜(40％飽和度)--->分級(jí)透析--->冷凍干燥--

3、->SepharoseCL-6B凝膠色譜。經(jīng)檢測(cè)純化后的PHB解聚酶，純化倍數(shù)為59.1，總酶活回收率為20％。 2、酶蛋白基本性質(zhì)：采用高效液相色譜對(duì)酶蛋白單一性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示樣品純度較好；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)為單一譜帶，依據(jù)PHB解聚酶的Rm求得其分子量為18000Da；采用連續(xù)聚丙烯酰胺等電聚焦電泳等電點(diǎn)pI為7.6；最適pH為8.6；化學(xué)試劑EDTA對(duì)PHB解聚酶抑制率最強(qiáng)，SDS，巰基乙醇使酶活損失較大，

4、H2O2，尿素對(duì)酶活抑制不明顯。 3、PHB解聚酶蛋白質(zhì)學(xué)研究：Agilentl100型氨基酸自動(dòng)分析儀分析樣品氨基酸組分，結(jié)果顯示，DS9713a菌株所產(chǎn)生的PHB解聚酶除Met外含有15種常見氨基酸，其中天冬氨酸和谷氨酸含量較高，其側(cè)鏈基團(tuán)可能在底物結(jié)合或酶的催化反應(yīng)中起作用；圓二色譜分析顯示酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)為：Helix：47.5％，Turn：24.3％，Random：28.2％；以PHB為底物，對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果