膠原包埋神經(jīng)干細胞低溫保存技術的研究.pdf

1、神經(jīng)干細胞的低溫保存對臨床醫(yī)學的細胞移植以及建立干細胞庫有著極為重要的意義。本課題是在選用傳統(tǒng)慢速凍存方法的同時將細胞包埋入鼠尾Ⅰ型膠原中，建立新型的冷凍體系。實驗中采用單一的DMSO溶液作為冷凍保護劑并考察了不同濃度的DMSO導入過程中體系外部溶液主體濃度的變化，從而推算出膠原一細胞體系內(nèi)部的DMSO平均濃度，進而確定最優(yōu)的冷凍保護劑濃度以及膠原濃度。實驗中選取的膠原濃度分別為0.5mg/ml，1.0mg/ml和1.5mg/ml，DM

2、SO濃度分別為15％(v/v)，20％(v/v)和25％(v/v)。根據(jù)體系外部冷凍保護劑的濃度變化確定保護劑的平衡時間，并通過物質守恒方程推算出體系內(nèi)部冷凍保護劑平均濃度在8％～15％(v/v)之間的實驗組進行慢凍保存。本文同時考察了降溫速率對細胞復蘇狀態(tài)的影響。文中選取了1℃/min、3.4℃/min和18.6℃/min三個降溫速率對神經(jīng)干細胞進行低溫保存，并進行冷凍復蘇后0h和24h的細胞活率比較、流式細胞凋亡檢測和ATPase活

3、力檢測以及復蘇細胞的誘導分化和免疫組化(Nestin，βtubulinⅢ，GFAP及RIP)檢測。 實驗結果表明神經(jīng)干細胞在膠原層中狀態(tài)良好，通過物質守恒方程篩選膠原系統(tǒng)內(nèi)部冷凍保護劑濃度適宜神經(jīng)干細胞低溫保存的實驗條件。膠原體系冷凍保護劑平衡時間要遠大于細胞懸液的平衡時間，起到了緩滲的作用。對6組實驗條件進行慢速冷凍保存，用膠原包埋的神經(jīng)干細胞復蘇后活率明顯高于其他單純的細胞懸液的冷凍保存，1℃/min和3.4℃/min的降溫

4、速率均可以達到較高的細胞復蘇率。其中1.5mg/ml膠原+20％DMSO條件下凍存復蘇后可得到88.5％的活率。從復蘇后細胞的凋亡狀態(tài)來看，采用膠原包埋的方法冷凍復蘇后健康細胞在78.5％～86.7％，有5％左右的細胞進入早期和晚期凋亡。傳統(tǒng)的方法健康細胞僅為38.5％，而且大多數(shù)細胞進入凋亡期。膠原包埋方法復蘇細胞的ATP酶活性高于傳統(tǒng)冷凍方法。經(jīng)過免疫組化的檢測，復蘇后的細胞為Nestin陽性細胞，保持了良好的干細胞性能，其可分化為