富鐵酵母細胞的培養(yǎng)及其在治療缺鐵性貧血中的應(yīng)用.pdf

1、鐵是人體必需的微量元素,在人體的代謝活動中具有十分重要的作用,鐵缺乏會引發(fā)缺鐵性貧血?？诜蛩醽嗚F是治療缺鐵性貧血的傳統(tǒng)方法,但硫酸亞鐵對胃腸道刺激性較大,患者很難堅持服用,因而影響治療效果。富鐵酵母具有吸收率高、刺激性小、營養(yǎng)豐富等特點,作為一種安全高效的新型鐵劑引起了人們的關(guān)注。
　　從40株Aureobasidium pullulans HN6.2敲除了GATA類型轉(zhuǎn)錄抑制因子編碼基因(SRE1)的敲除菌株中篩選得到一株富鐵

2、能力最強的菌株R6,R6菌株在加鐵培養(yǎng)基中依然能產(chǎn)生大量鐵載體,細胞內(nèi)外鐵載體總產(chǎn)量約12.2mg/gdw,而野生型菌株在加鐵環(huán)境中鐵載體合成受到強烈阻遏。利用R6菌株這一特性,通過優(yōu)化加鐵的時間,初步得到了富鐵酵母細胞的制備方法:在缺鐵培養(yǎng)基中培養(yǎng)R6菌株,培養(yǎng)至24h時加入終濃度為1.5 mM的FeCl3,繼續(xù)培養(yǎng)至120h,收獲富鐵酵母細胞。在50 mL搖瓶體系中,R6菌株胞內(nèi)鐵離子富集量最大可達11.9 mg/g dw。

3、　　分別用加鐵和缺鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)野生型及R6菌株,通過實時熒光定量PCR的方法研究鳥氨酸羥基化酶基因(SIDA)在兩種培養(yǎng)條件下的相對表達量。野生型菌株在加鐵培養(yǎng)基中的SIDA基因表達量是缺鐵培養(yǎng)基中的27.3％,R6菌株在加鐵培養(yǎng)基中的SIDA基因表達量是缺鐵培養(yǎng)基中的74.1%,說明R6菌株部分解除了鐵離子對 SIDA基因表達的阻遏作用。鐵離子阻遏的解除使敲除菌株 R6在加鐵培養(yǎng)基中鐵載體產(chǎn)量高于野生型菌株,因而能富集更多的鐵。

4、>　　對富鐵酵母進行擴大化培養(yǎng)。在1.5 L發(fā)酵體系中R6菌株胞內(nèi)鐵離子富集量為5.15 mg/g dw。為提高R6菌株鐵離子的富集量,在50 mL搖瓶體系中對加鐵濃度進行優(yōu)化,得到鐵離子最適終濃度為15 mM。采用優(yōu)化后的加鐵濃度進行6 L體系發(fā)酵培養(yǎng),R6菌株胞內(nèi)鐵離子富集量最高可達27.79 mg/g dw。發(fā)酵48 h時,R6菌株胞內(nèi)鐵離子富集量已達26.59 mg/g dw,且總糖已消耗96%以上,在這種情況下可提前結(jié)束發(fā)酵,

5、這大幅度縮短了富鐵酵母的制備時間。
　　將富鐵酵母試用于小鼠缺鐵性貧血的治療。首先采用急性毒性實驗對富鐵酵母的安全性進行評價。對健康小鼠一次性灌胃10 g/kg富鐵酵母,連續(xù)觀察14天,小鼠未出現(xiàn)中毒和死亡,表明富鐵酵母安全無毒。通過低鐵飲食輔以慢性失血的方法成功制備了小鼠的缺鐵性貧血模型,貧血小鼠血紅蛋白含量降為89 g/L,紅細胞計數(shù)降為5.9×1012 cells/L。與正常小鼠相比,模型小鼠體重增長緩慢,表明鐵缺乏影響了小