骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細胞誘導異體皮膚長期存活的機理探索.pdf

1、背景：大面積的創(chuàng)傷需要大量健康組織修復缺損，自體組織往往無法彌補這樣的缺陷，異體復合組織的移植使得解決這個問題成為了可能。但是異體復合組織移植仍面臨一些問題，其中最為關(guān)鍵的是如何延長移植物的存活時間，降低免疫抑制劑的毒副作用。
　　免疫耐受是指受體的免疫系統(tǒng)不再攻擊供體來源的組織。異體造血干細胞或骨髓移植的方法是公認的誘導免疫耐受的重要方法。異體骨髓細胞中的供體來源的造血干細胞如果可以在受體骨髓腔內(nèi)定植，它們會在受體內(nèi)發(fā)育成熟為具

2、有正常免疫功能以及抗原提呈功能的細胞。接著，這些異體來源的細胞不會攻擊同一供體來源的細胞及組織器官，從而延長異體移植物的存活時間，甚至免疫耐受狀態(tài)的建立。
　　異體骨髓移植仍存在著兩個問題。第一，異體骨髓細胞仍可能誘發(fā)受體對其免疫排斥反應，所以仍然需要大劑量的免疫抑制、照射等副作用較大的免疫誘導方案。第二，異體造血干細胞在受體體內(nèi)定植需要供體來源的骨髓微環(huán)境，而通過靜脈注射的方法，難以成功移植供體來源的造血干細胞微環(huán)境。
　

3、　骨髓腔內(nèi)注射可以提高異體造血干細胞的定植效率，延長異體實體器官的存活時間，降低移植物抗宿主反應的發(fā)生。雖然已經(jīng)有學者對于這一現(xiàn)象進行了初步的探索，但是對于骨髓腔內(nèi)注射是否可以延長異體皮膚的存活時間，誘導局部骨髓中微環(huán)境的改變?nèi)匀蝗狈μ剿?。這些研究對于異體骨髓移植中異體造血干細胞功能和局部骨髓免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)仍然缺乏深入的闡述。此外，局部照射聯(lián)合骨髓腔內(nèi)注射可否延長異體皮片的存活時間，并降低免疫誘導方案對于受體的毒副作用呢？對于這些問題的

4、探索有助于我們更好的改變局部骨髓微環(huán)境，促進異體造血干細胞的定植并延長異體皮片的存活時間，為促進異體復合組織的長期存活提供新的治療方案。目標：1）探索骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細胞是否可以誘導異體皮片的長期存活；2）探索骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細胞是否可以誘導局部骨髓中間質(zhì)微環(huán)境和免疫微環(huán)境改變，這些改變是否可以延長異體皮膚的長期存活；3）探索骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細胞聯(lián)合局部照射可否延長異體皮片的長期存活。
　　方法：
　　1)預處理

5、模型以及皮片移植的模型的建立：受體小鼠經(jīng)過4Gy X射線全身照射并給予骨髓腔內(nèi)注射供體來源的5×106的骨髓細胞。骨髓細胞移植后3周，受體接受同一供體來源1x1cm的鼠尾全厚皮片移植。待排斥終點，取材并進行病理切片。
　　2)外周血嵌合體水平的測定：骨髓移植后1周、3周、12周、18周分別從小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血，使用流式細胞技術(shù)測量供體細胞在外周血白細胞、粒細胞、T細胞、B細胞中的比例。
　　3)骨髓及脾臟中供體來源造血干細胞

6、、間質(zhì)細胞、間質(zhì)干細胞、調(diào)節(jié)性T細胞比例：分別在術(shù)后3周、12周測定受體注射側(cè)骨髓以及未注射側(cè)骨髓供體來源造血干細胞（H-2Kb+c-kit+sca-1+lineage-）、供體間質(zhì)細胞（H-2Kb+CD45-CD31-TER119-）、供體間質(zhì)干細胞（H-2Kb+CD45-CD31-TER119-PDGFR-α+）、調(diào)節(jié)性T細胞（CD4+Foxp3+）比例。
　　4)測定骨髓及脾臟中細胞因子的表達：分別在術(shù)后3周、12周使用實時

7、定量PCR以及Western Blotting等測定骨髓和脾臟細胞中IL-2、IL-10、TGF-β等的表達水平。
　　5)手術(shù)去除局部注射骨髓：在異體骨髓移植后，分別在術(shù)后7天和21天手術(shù)去除局部注射脛骨，術(shù)后3周、12周測定外周血及脾臟中供體細胞比例，并測定脾臟中調(diào)節(jié)性T細胞比例，術(shù)后3周接受異體來源的皮片移植。
　　6)局部照射模型：使用3mm厚度的鉛板，并且修剪鉛板露出左側(cè)脛骨，給予局部脛骨30Gy的X射線照射。局部

8、照射后，通過病理切片觀察局部照射的效果。小鼠體重作為小鼠健康的指標并進行長期監(jiān)測。
　　7)統(tǒng)計學分析：使用student t檢驗進行靜脈注射組、骨髓腔內(nèi)注射組、假手術(shù)組等兩兩之間的比較。使用配對t檢驗比較注射側(cè)骨髓及對側(cè)骨髓的數(shù)據(jù)。Log-rank檢驗方法用于分析生存曲線數(shù)據(jù)。P值小于0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1）骨髓腔內(nèi)注射可以較靜脈注射骨髓細胞延長異體皮片存活時間，并且誘導各系細胞的嵌合體水平增

9、高。骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細胞可以較靜脈注射和假手術(shù)組延長異體皮片的存活時間（中位存活時間：骨髓腔內(nèi)注射組，60天；假手術(shù)組，32.5天；靜脈注射組，29.5天）并升高外周血中B細胞、T細胞、粒細胞中供體細胞的水平，尤其升高了早期外周血中供體來源粒細胞水平。
　　2）骨髓腔內(nèi)注射主要改變了局部注射骨髓的間質(zhì)細胞微環(huán)境。相較于靜脈注射組和假手術(shù)組，骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細胞可以將大多數(shù)局部注射骨髓的受體來源間質(zhì)細胞替換為供體來源的細胞（

10、術(shù)后12周，注射側(cè)骨髓76.2％，未注射側(cè)骨髓33.3%，P＜0.05），并提高了局部注射骨髓中間質(zhì)干細胞的比例。
　　3）骨髓腔內(nèi)注射可以升高局部注射骨髓中受體來源調(diào)節(jié)性T細胞的比例。相較于未注射骨髓，骨髓腔內(nèi)注射可以在早期（術(shù)后3周）升高局部注射骨髓中受體來源調(diào)節(jié)性T細胞的比例，而在晚期這種差異逐漸消失。同時，調(diào)節(jié)性T細胞比例的升高還伴有IL-10等細胞因子表達的升高，而TGF-β、IL-2等卻沒有升高。
　　4）早期（

11、術(shù)后7天）去除局部注射骨髓可以使得供體來源細胞比例降低。在術(shù)后7天而非21天去除局部注射骨髓，可以使得供體來源細胞及造血干細胞的比例明顯降低，但是還不足以影響供體皮片的存活時間。
　　5）局部照射聯(lián)合免疫抑制劑及骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細胞可以提高外周血中供體細胞的比例，但是不足以誘導免疫耐受或者延長異體皮片的存活時間。局部照射（30 Gy X射線）聯(lián)合免疫抑制劑（腹腔注射雷帕霉素2mg/kg/天14天）及骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細胞可以

12、顯著提高外周血中供體細胞的比例，并一定程度延長異體皮片的存活時間，但兩組之間并無統(tǒng)計學差異。
　　6）局部創(chuàng)傷的作用不足以改變局部骨髓的微環(huán)境。在以上的實驗中，局部注射PBS并沒有導致局部注射骨髓與假手術(shù)組之間出現(xiàn)明顯供體細胞比例、造血干細胞比例、間質(zhì)細胞比例、間質(zhì)干細胞比例、調(diào)節(jié)性T細胞比例及相關(guān)細胞因子的變化的統(tǒng)計學上的差異。
　　結(jié)論：
　　我們的研究中有以下發(fā)現(xiàn)：
　　1）在本實驗室建立了骨髓腔內(nèi)注射聯(lián)合

13、非致死劑量的全身照射延長異體皮片長期存活的小鼠模型，并證實了骨髓腔內(nèi)注射可以較靜脈注射延長異體皮片的存活時間。
　　2）本研究首次證實了骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細胞可以替換局部注射骨髓的間質(zhì)微環(huán)境并且升高局部注射骨髓中調(diào)節(jié)性T細胞及免疫抑制相關(guān)細胞因子的表達。
　　3）骨髓腔內(nèi)注射異體骨髓細胞可以早期（7天）促進異體造血干細胞在受體局部注射骨髓中定植，但是這種作用在術(shù)后21天消失。
　　4）我們首次試圖使用聯(lián)合局部照射以及