堿性脂肪酶生產(chǎn)菌株的誘變選育、堿性脂肪酶的分離純化與固定化初探.pdf

1、脂肪酶能在油．水界面上催化酯水解或醇解、酯交換、酯合成、多肽合成、高分子聚合以及手性化合物拆分等反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑和皮革等方面。 本文以實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)堿性脂肪酶菌株Serratia sp．SL-11為原始菌株，考察了紫外照射、微波、亞硝基胍以及硫酸二乙酯等傳統(tǒng)誘變方法對(duì)該菌的誘變效果。最終篩選到了一株產(chǎn)酶量比原始菌株提高75％的突變株(DES處理獲得)，經(jīng)搖瓶發(fā)酵后上清的脂肪酶活性能達(dá)到198U/mL，連續(xù)傳代5

2、次產(chǎn)酶量穩(wěn)定。藥對(duì)Serratia sp．sL-11所產(chǎn)堿性脂肪酶進(jìn)行了分離純化。菌體發(fā)酵液經(jīng)Phenyl-Sepharose疏水作用層析和DEAE-Sepharose離子交換層析處理后，得到了純化后的堿性脂肪酶，用 SDD-聚丙烯酰胺凝膠電泳利等電聚焦檢測(cè)其純度為電泳純。該酶的純化倍數(shù)為31.96倍，活性的回收率為39.61％，比活力達(dá)到5752.12U/mg。理化性質(zhì)研究表明，脂肪酶全分子量約為292.3KD，由四個(gè)分子量為70.9

3、KD的相同亞基組成，其等電點(diǎn)為5。48． 用pCMB、pMSF、NBS、NAI、BrAc、DTT、BD、順丁烯二酸酐和氯胺-T等修飾劑對(duì)該脂肪酶的功能基團(tuán)進(jìn)行研究。修飾的結(jié)果表明，經(jīng)NBS、順丁烯二酸酐和氯胺-T修飾后．脂肪酶活性受到抑制，而經(jīng)pCMB、pMSF、NAI、BrAc、DTT和BD修飾后的脂肪酶活性沒(méi)有變化。由此可知，色氨酸吲哚基、賴氨酸ε-氨基和甲硫氨酸硫醚基是維持該堿性脂肪酶活性的必需基團(tuán)。 在實(shí)際應(yīng)用中

4、，使用游離酶作為催化劑有很多局限性。本論文對(duì)該堿性脂肪酶的固定化方法及條件做了初步探討，研究了吸附載體的種類、緩沖液的pH值、作用溫度、酶的使用量、海藻酸鈉溶液的濃度、氯化鈣的濃度以及固化時(shí)間對(duì)固定化脂肪酶的影響。結(jié)果表明，在pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，固定化載體Phenyl-Sepharose凝膠與游離脂肪酶的質(zhì)量比為10∶1(g/mg)的條件下，于50℃溫和振蕩1小時(shí)，得到的因吸附作用固定化的脂肪酶相對(duì)酶活性最高。為280