計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)高活性小分子新型SAHA衍生物及其合成與生物活性評(píng)價(jià).pdf

1、背景：組蛋白去乙?；敢种苿?Histone Deacetylase Inhibitors,HDACi)憑借其靶點(diǎn)性強(qiáng)、臨床應(yīng)用廣泛、治療毒副作用相對(duì)較小等眾多優(yōu)勢(shì)獲得研究者的關(guān)注。多年來(lái)大量的臨床試驗(yàn)結(jié)果證明 HDACi對(duì)多種癌癥均有顯著的療效,雖然其抗癌作用機(jī)理仍未完全明了。但是,通過(guò)組蛋白乙?；揎椬饔糜绊懟蜣D(zhuǎn)錄活性和表達(dá)而發(fā)揮作用已經(jīng)得到很多研究確證。HDACi作用腫瘤細(xì)胞后能夠抑制腫瘤細(xì)胞中失調(diào)高度激活表達(dá)的組蛋白去乙?；?/p>

2、(Histone Deacetylases,HDACs),起到提升相應(yīng)的原抑癌基因的表達(dá)水平,從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞無(wú)限增值、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期檢查和凋亡,導(dǎo)致促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡?，F(xiàn)今已經(jīng)有許多 HDACi抗癌藥物投入到了臨床試驗(yàn)階段上,這些抑制劑中最早通過(guò)臨床試驗(yàn)成功上市的SAHA已被美國(guó)所屬的食品藥物管理局(FDA)授權(quán)實(shí)際應(yīng)用于臨床各型腫瘤治療以及預(yù)防中,但十分讓人感到可惜的是現(xiàn)階段研究的 HDACi絕大多數(shù)為非特異性組蛋

3、白去乙酰化酶抑制劑(nonspecific-HDACi),這就造成了很多臨床治療中出現(xiàn)的副作用,所以導(dǎo)致 HDACi在臨床上的使用也受到了相當(dāng)大的應(yīng)用限制。以經(jīng)典藥物伏立諾他(SAHA)類HDACi的結(jié)構(gòu)為母體結(jié)構(gòu),結(jié)合現(xiàn)代藥物設(shè)計(jì)方法-計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(Computer-Aided Drug Design,CADD),設(shè)計(jì)、合成了一系列新型的SAHA類衍生物,對(duì)這些衍生物與HDAC酶的作用方式進(jìn)行了分析比較,并且對(duì)其進(jìn)行了抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

4、生物活性評(píng)價(jià)以及其抗腫瘤的分子機(jī)制進(jìn)行研究和探討。希望通過(guò)對(duì)SAHA表面結(jié)構(gòu)區(qū)的修飾增加這類抑制劑對(duì)HDAC的抑制活性,減少其毒副作用。
　　目的：根據(jù)經(jīng)典的組蛋白去乙?；敢种芐AHA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和分子對(duì)接原理,采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)小分子 SAHA類衍生物結(jié)構(gòu),進(jìn)行化學(xué)合成,然后,通過(guò)細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn),檢測(cè)其對(duì)HDACs的抑制活性、對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用以及對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用,評(píng)價(jià)其作用于藥物靶點(diǎn)的能力、抗腫瘤活性和毒性作用。篩選出

5、具有高活性、低毒性的HDACi,并且對(duì)其誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和自噬的分子機(jī)制進(jìn)行探討。
　　方法：分子對(duì)接以HDAC8(PDBcode1T69)為篩選模型對(duì)比SAHA使用Autodocking等對(duì)接軟件進(jìn)行SAHA類衍生物-HDAC8酶活性對(duì)接。分析對(duì)接結(jié)果顯示,對(duì)接分?jǐn)?shù)比較高的衍生物在理論上能與 HDAC8酶親和性更強(qiáng)。從而篩選出這些高分衍生物,通過(guò)酰胺反應(yīng)和異羥肟酸結(jié)合進(jìn)行合成。CCK-8的方法考察了這些衍生物對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖

6、活性抑制作用以及對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用,篩選濃度在0.1μM到30μM之間,研究細(xì)胞株為人膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGR2、U373、U251和人正常細(xì)胞肝細(xì)胞LO2、人正常肺細(xì)胞MRC5。使用Elisa方法考察了抑制劑對(duì)Beclin-1, Caspase-3,9和Bcl-2活性的影響。通過(guò)腹腔注射(I.P.)不同濃度的 HDACi到小鼠體內(nèi),在不同時(shí)間點(diǎn)取小鼠腦和肺組織經(jīng)過(guò)研磨破碎,通過(guò)HPLC測(cè)定抑制劑濃度值,確認(rèn)HDACi是否能到達(dá)靶點(diǎn)器官；Bl

7、iss法測(cè)定藥物在小鼠中的LD50值,考察抑制劑對(duì)小鼠的毒副作用。
　　結(jié)果：這些抑制劑在與HDAC8分子對(duì)接結(jié)果中均比陽(yáng)性對(duì)照SAHA分?jǐn)?shù)高,理論上與靶點(diǎn)組蛋白去乙?；赣懈叩挠H和力；在體外抗膠質(zhì)腫瘤活性研究實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明,這些新的SAHA類衍生物均能抑制HDACs和腫瘤細(xì)胞增殖,且作用敏感。對(duì)比陽(yáng)性藥物SAHA其中以N3F,N2E,N25為代表化合物對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療效果均強(qiáng)于SAHA表現(xiàn)更出色。呈現(xiàn)出對(duì)癌細(xì)胞高殺傷性,對(duì)正

8、常人細(xì)胞低毒性的特點(diǎn)。尤其是化合物N3F和N2E表現(xiàn)出色,在U251細(xì)胞中N3F的IC50=0.1187μM,正常細(xì)胞中毒性低。構(gòu)效關(guān)系研究表明,通過(guò)對(duì)SAHA表面結(jié)構(gòu)區(qū)進(jìn)行修飾,能夠增強(qiáng)這些新衍生物對(duì)HDAC酶的抑制作用。其中N3F能明顯促進(jìn)Beclin-1,Caspase-3,9活性,抑制Bcl-2的活性。并且抑制Caspase酶活性后能明提升Beclin-1表達(dá)。N25小鼠體內(nèi)分布研究實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)N25能穿過(guò)血腦屏障順利達(dá)到靶點(diǎn)器官

9、(腦)從而發(fā)揮治療效果。而且N25在小鼠的毒性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中呈較低毒性(LD50：240.840mg/kg)。以上結(jié)果表明對(duì)SAHA-Cap結(jié)構(gòu)的修改能得到高活性、低毒性的小分子化合物。
　　結(jié)論：根據(jù)異羥肟酸類結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)、合成新型的SAHA衍生物,研究了其與HDAC8相互作用,并且對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了波普鑒定。針對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行了一系列細(xì)胞活性的篩選,選取較為敏感的細(xì)胞株進(jìn)行 HDAC酶活性測(cè)定。篩選出活性更高活性的新型 SAHA類構(gòu)造