GEN1對(duì)乳腺癌細(xì)胞藥敏的影響及其相關(guān)機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的:
　　研究GEN1干擾對(duì)乳腺癌SKBR3和MCF-7細(xì)胞化療敏感性的影響，并探討GEN1干擾在不同乳腺癌細(xì)胞中帶來不同效應(yīng)的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　通過抽提獲得大量高純度shRNA干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)干擾效果，篩選最佳干擾質(zhì)粒。利用最佳干擾質(zhì)粒干擾乳腺癌SKBR3和MCF-7細(xì)胞中GEN1的表達(dá);RT-PCR和Western blot檢測(cè)干擾效果;用新型四唑單鈉鹽試

2、劑盒(CCK-8)檢測(cè)不同5-氟尿嘧啶(5-FU)濃度及IC50濃度下實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞存活率;用AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)5-FU作用下實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡水平變化，研究GEN1干擾對(duì)乳腺癌SKBR3和MCF-7細(xì)胞化療敏感性的影響。將Mus81高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行GEN1和Mus81同時(shí)干擾，CCK-8細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞存活率的變化;用低濃度5-氟尿嘧啶(5-FU)處理sh-Mus81

3、單干擾組和陰性對(duì)照組MCF-7細(xì)胞96 h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中GEN1和Mus81表達(dá)水平變化;用低濃度5-FU處理正常SKBR3和MCF-7細(xì)胞96 h，Westernblot檢測(cè)處理前后細(xì)胞中GEN1表達(dá)水平變化，探討GEN1干擾在不同乳腺癌中帶來不同效應(yīng)的相關(guān)機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.抽提的shRNA干擾質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒經(jīng)測(cè)定后濃度和純度均達(dá)到要求，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。R

4、T-PCR結(jié)果表明:3號(hào)GEN1和2號(hào)Mus81干擾質(zhì)粒干擾效果最佳。
　　2.利用最佳干擾質(zhì)粒干擾乳腺癌SKBR3和MCF-7細(xì)胞中GEN1的表達(dá)后，RT-PCR和Western blot證明GEN1干擾效果良好;CCK-8細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)表明:實(shí)驗(yàn)組SKBR3細(xì)胞存活率較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05）;實(shí)驗(yàn)組MCF-7細(xì)胞存活率較對(duì)照組無明顯變化(P＞0.05); AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示:實(shí)驗(yàn)組SKBR3細(xì)胞

5、凋亡水平較對(duì)照組明顯增高(P＜0.05）;實(shí)驗(yàn)組MCF-7細(xì)胞凋亡水平較對(duì)照組無明顯變化(P＞0.05）。以上結(jié)果表明，GEN1干擾可以顯著提高SKBR3對(duì)5-FU的化療敏感性，但對(duì)MCF-7對(duì)5-FU的化療敏感性無明顯影響，相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
　　3.同時(shí)干擾GEN1和Mus81后，MCF-7對(duì)5-FU的化療敏感性明顯增強(qiáng)(P＜0.05);在低濃度5-FU持續(xù)作用下，sh-Mus81組MCF-7細(xì)胞中GEN1表達(dá)水平明顯

6、提高(P＜0.05）;在低濃度5-FU持續(xù)作用下，SKBR3細(xì)胞中GEN1水平明顯提高(P＜0.05)，而MCF-7細(xì)胞中GEN1水平未見明顯變化(P＞0.05)。以上結(jié)果表明，GEN1干擾對(duì)乳腺癌細(xì)胞化療敏感性的影響，同Mus81的表達(dá)水平密切相關(guān)。在Mus81高表達(dá)時(shí)，GEN1干擾對(duì)藥敏沒有明顯影響;當(dāng)Mus81表達(dá)降低時(shí)，干擾GEN1可以明顯提高乳腺癌對(duì)5-FU的化療敏感性。
　　結(jié)論:
　　GEN1干擾可以明顯增強(qiáng)S